USPIO标记大鼠骨髓源神经干细胞体外磁共振成像研究

杨志军 白妙春 陈中灿 戴宜武 徐如祥 (北京军区总医院神经外科，北京 100700)

USPIO标记大鼠骨髓源神经干细胞体外磁共振成像研究

杨志军 白妙春 陈中灿 戴宜武 徐如祥*
(北京军区总医院神经外科，北京 100700)

目的应用磁共振成像技术(MRI)观察超小超顺磁性氧化铁(USPIO)欣诺(Sinerem)标记后的大鼠骨髓源神经干细胞体外成像情况。方法分离大鼠骨髓基质干细胞，体外培养诱导成神经干细胞。以200 μg/ml的浓度105个细胞用不同的自旋回波序列T1WI、T2WI与T2*WI在2%的琼脂糖凝胶中模拟在体环境分别行4.7T扫描确定最佳的扫描序列。将不同浓度(0、25、50、100、200、500 μg/ml)Sinerem和干细胞共孵育培养过夜标记后置于2%的琼脂糖凝胶中，以自旋回波序列T2*WI磁共振干细胞成像；并在磁共振下观察不同数量细胞200 μg/ml Sinerem标记细胞(101个，102个，103个，104个，105个)的信号情况。观察细胞在浓度200 μg/ml(106个)标记时经长期培养不同时间点时的信号变化。结果MRI扫描结果提示序列T2*WI扫描的敏感性最强。不同浓度的Sinerem标记细胞的磁共振信号强度不同，随着Sinerem浓度的升高MRI信号呈降低趋势，浓度为500 μg/ml时信号强度最低，肉眼观察可看到浓度100 μg/ml以上标记细胞的MRI的信号强度明显低于对照样品，可进行区分。标记细胞数量达103个及以上时在磁共振下其信号变化能被观察到。106个标记细胞的信号随培养时间的延长逐渐增加，4 w时仍能在磁共振下显示可区分的低信号。结论利用Sinerem标记的骨髓源神经干细胞体外可在MRI下呈现可视区别的低信号影，T2*WI序列是最敏感的序列；信号强度的高低可用于评估标记细胞的数量。Sinerem标记的细胞可用于磁共振下进行长期的示踪。

神经干细胞; 骨髓基质细胞; 核磁共振成像; 超小超顺磁性氧化铁; 欣诺

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)可以向神经干细胞(neural stem cell, NSCs)、神经元和神经胶质细胞方向分化[1]，为了与来源神经组织的NSCs相区别，将此种由骨髓基质细胞诱导而来的NSCs称为骨髓基质细胞源NSCs(bone marrow stromal cells derived from neural stem cells, BMSCs-D-NSCs)。由于BMSCs容易获取、可在体外大量扩增并在一定条件下能诱导成神经干细胞，因此成为NSCs的重要来源随着影像学的发展，MRI活体示踪技术逐渐应用到干细胞移植领域。超小超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)欣诺(sinerem )是一类新型的纳米级的超顺磁性氧化铁微粒，是临床上被批准使用的新型MRI造影剂[2,3]。由于其自身特殊的磁性，可在磁场作用下与周围组织进行不同的成像，如果用其标记干细胞，就可以进行影像学的无创监测。本文体外模拟活体组织微环境，对其在磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)下的敏感性、成像情况等进行了研究和评价，为下一步体内的真正应用建立基本的参数和探讨最佳的扫描方法。

材料与方法

一、实验动物

清洁级健康成年雄性SD大鼠，体重180～220 g 。经检疫符合实验动物标准。实验进行期间饲养于北京军区总医院神经外科实验室动物房内。

二、主要试剂和仪器

神经干细胞培养基(专利号：02134314.4)，北京军区总医院神经外科实验室自行配制；碱性成纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)，Sigma公司；维甲酸(retinoic acid, RA)，Sigma公司；胎牛血清，杭州四季青；多聚赖氨酸(polylysine, PLL)，Sigma公司；Sinerem，法国geurbet公司；白血病抑止因子(leukaemia inhibitory factor, LIF)，Sigma公司；琼脂糖(agarose)，Promega公司；Brucker 4.7T超导核磁共振成像系统，美国；透射电子显微镜(JEOM2100SX)，日本。

三、大鼠BMSCs的分离及BMSCs-D-NSCs方向的诱导

用10%的水合氯醛(0.4 ml/100 g)对大鼠进行腹腔注射麻醉， 12号注射针穿透骨皮质至骨髓腔，以浓度为500 U/ml肝素湿化处理注射器并力抽吸骨髓，所获骨髓用Hank's液稀释，细胞悬液按1 ∶2比例加入到分离液(percoll, Sigma)中进行2 500 rpm×15 min密度梯度离心，离心后小心吸取富含有核细胞的界面层,，以2 ml双蒸水(4℃)吹打细胞约1 min以破坏红细胞，再加入培养基终止红细胞溶解，800 rpm离心5 min，去上清，沉淀物即含BMSCs，加相同神经干细胞培养基悬浮细胞，并加胎牛血清(1%终浓度)接种于24孔培养板和培养瓶中。于5%CO2、37℃培养箱中培养。当细胞生长至80%融合时2～3 d换液一次。以0.25%胰酶消化细胞。2～3次传代后，收集细胞悬液，调整密度为1×106/ml备用。

四、BMSCs-D-NSCs的Sinerem体外标记

首先将Sinerem (20 mg/ml)和PLL(1.5 mg/ml)加入到无血清的NSCs培养基中，使两者的浓度分别为400 μg/ml和1.5 μg /ml，在振荡器上室温孵育60 min，然后加入等体积诱导后的细胞悬液中，二者在细胞悬液中的终浓度分别为200 μg/ml和0.75 μg/ml，在37℃、5%CO2条件下孵育16 h，去除培养基，用Hank's液洗涤2次以洗去游离的SE和PLL，静置备用。

五、体外琼脂糖凝胶的配制、细胞的磁共振扫描

六、不同MR序列扫描敏感性实验

将200 μg/ml Sinerem标记24 h后的105个细胞置于20 μl的琼脂糖凝胶中，共6孔，分别行SE T1WI、T2WI和GRE序列T2*WI成像，分析信号变化。扫描方法：SE T1WI:TR 500 ms，TE 15 ms；SE T2WI：TR 4 000 ms，TE 100 ms；T2*WI：TR 300 ms，TE 20 ms。头线圈，层厚3 mm，矩阵256×160，视野6 cm×6 cm～8 cm×8 cm。信号分析：分别测量感兴趣区信号，信号改变以下列公式计算：ΔSI=[(SIL-SIU)/ SIU]×100% (ΔSI为信号变化率，SIL为标记细胞信号，SIU为未标记细胞信号)。

七、不同浓度Sinerem标记BMSCs-D-NSCs的体外MR扫描成像

按上述方法分别将106个不同浓度Sinerem(0 μg/ml，25 μg/ml，50 μg/ml，100 μg/ml，200 μg/ml，500 μg/ml)标记的BMSCs-D-NSCs置于2%琼脂糖(60℃悬浮，室温凝固)中，行4.7T核磁共振T2*WI序列扫描，观察成像情况。

八、不同数量标记细胞的MRI扫描成像

将1 μl 200 μg/ml浓度Sinerem标记的不同数量的细胞(101、102、103、104、105及106个细胞/μl)，置于凝胶中，按上述方法行4.7T核磁共振扫描。

九、标记细胞不同时相的扫描

为了确定Sinerem标记细胞随时间延长信号的变化情况，将106个标记细胞进行定期(1 d、1 w、2 w、3 w及4 w)体外成像检测，观察MRI成像的改变。

十、统计学分析

图1 制备的浓度为2%的琼脂糖凝胶

Fig 1 The preparation of 2% agarose gel

The gel density and thickness are equal. The diameter is about 5 cm and the thickness is 0.7 cm. The arrow indicates the hole for the cells.

图2 凝胶中加入标记细胞后的图像

Fig 2 The picture of agarose gel grafted with labeled cells

The cells in the hole showed light yellow.

图3 不同序列扫描的信号变化率比较

Fig 3 Comparison of signal change with different scanning sequences

1: T1WI; 2: T2WI; 3: T2*WI. The signal changes of T2WI and T2*WI were more significant than those of T1WI. And T2*WI signal change was the most.

图4 不同浓度铁标记细胞MR扫描凝胶图

Fig 4 MR Scanning of cells labeled with different Sinerem concentration

1～6 indicates 0～500 μg/ml Sinerem concentration respectively; the signal decrease was accompanying with the Sinerem concentration decrease. Arrow represents 200 μg/ml Sinerem labeling.

图5 不同数量细胞MR扫描凝胶图

Fig 5 MR scanning of labeled different number cells

1～6 holes represent cell number from 10～106, respectively. The low signal area begins from the third hole and become larger with the cells number increasing.

图6 106个细胞不同时相扫描结果

Fig 6 MR scanning of labeled 106cells at different time points

1～5 holes represent the scanning time points from 1 d～4 w, respectively. The signal becomes higher, but the low signal area still can be distinguished.

结 果

一、凝胶中标记细胞的MRI成像敏感性检测结果

2%琼脂糖凝胶制作后，呈均匀的乳白色凝胶(图1)。加入细胞后呈棕黄色(图2)。其中的标记细胞经T1WI、T2WI和T2*WI三组序列扫描后所得的核磁共振成像信号变化率分别为-30.22±0.23、-92.31±0.79和-94.42±0.58。单因素方差统计方法分析结果显示：各组间的变化率存在统计学差异(F=304.5，P=0.000 )，GRE序列的T2*WI信号变化最明显(图3)。提示T2*WI序列扫描时最敏感。

二、不同浓度铁标记后的扫描结果

体外经MRI扫描，可见信号强度由高到低，与Sinerem的浓度(从左至右，从上至下增高)成负相关，浓度为200 ug/ml及其以上时，能清楚显示低信号区(图4)。

三、不同数量标记细胞的MRI扫描结果

由凝胶中扫描图见信号随细胞数量的增加而降低，能观察到的最低细胞量为103个，大于该数量时也能观察到。103以上时可明显呈低信号 (图5)。

四、标记细胞不同时相的扫描结果

扫描凝胶可见从左到右随着时间的增加，细胞MRI信号逐渐增强，信号区暗区逐渐减少，虽然提示铁量随时间延长而减少，但至4 w时所呈低信号像仍能与周围凝胶相区别 (图6)。

讨 论

干细胞具有治疗神经系统疾病的潜能[4]。静脉注射或直接移植干细胞后需要细胞的连续成像以示踪目标区的细胞。MRI是临床应用和生物医学研究中的重要方法，具有高组织分辨率、空间分辨率、无游离辐射、非侵袭性和通用性等特点，故在活体细胞尤其是干细胞的示踪监测中前景较好。

与钆类MRI对比剂二乙二胺五醋酸钆(gadolinium-DTPA, Gd-DTPA)相比，超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide, SPIO)更为安全，临床应用最多的是菲立磁(ferumoxides)，其平均直径为80纳米，核心氧化铁直径为20纳米[5]。SPIO由于颗粒较大，很容易被网状内皮细胞识别并吞噬，在血管的停留时间不长，一般主要被肝脾的网状细胞摄入，用于肝脾造影，不能用于全身，有很大的局限性。USPIO最大直径小于30 纳米[6]。目前常见的有Guerbet公司AMI-227(Sinerem)和Nycomed公司的FeO-BPA 两种制剂，前者平均直径20纳米，核心直径4～6纳米，已被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)获准使用。USPIO因其颗粒小，影响了吞噬细胞对它的摄取，使其在血管中停留的时间较长。因而可以通过毛细血管壁，更广泛的分布与血池及组织中，用于全身造影[7,8]。

由于磁共振对比剂是一种用于动物或人体组织检测病变的试剂，属于药物一类，因此，对其要求比较高。所需材料要求具有生物与组织相容性，无毒，在特定时间内能够排除体外[9]。铁元素本身是人身体所必需的一类物质，基于这一考虑，氧化铁既具有超顺磁性，又不会对身体造成大的伤害，是作为磁共振对比剂的较佳选择。裸氧化铁粒子不能直接用于磁共振造影，外面必须包覆一层具有组织相容性，可降解的物质，这种物质的一个作用是具有特异性，另一个重要作用是对氧化铁纳米粒子的分散。葡聚糖(dextran)属于高聚物，可降解，亲水，具有生物和组织相容性。用葡聚糖对氧化铁纳米粒子进行分散属于上面加入分散剂，即我们选用葡聚糖作为有机高聚物分散剂[10]。

干细胞磁标记后其MRI信号发生改变是MRI活体示踪的基础，而MRI信号的改变受对比剂种类、标记效率、细胞数量等的影响。超顺磁性氧化铁由于其特殊的化学结构，即使在较弱的磁场中也可产生较大的磁性，外磁场撤消后磁性也迅速消失，即所谓超顺磁性[11]。超顺磁性氧化铁颗粒分布于组织后，呈不均匀分布，造成局部磁场的不均匀，从而加速了质子去相位的T2弛豫，使组织信号降低，而对T1影响较小。本文主要探讨了体外Sinerem标记的BMSCs-D-NSCs在磁共振下的成像特点，结果发现2%琼脂糖凝胶是一种简便易行的组织模拟方法，MRI三种扫描序列扫描都能检测到信号的变化，但以T2*WI序列最为敏感。不同浓度铁标记细胞后的扫描结果提示Sinerem的浓度为200 μg/ml时及以上时，能清楚显示低信号区，说明了200 μg/ml是一个比较合适的标记浓度。通过不同数量铁标记细胞的MRI扫描，发现能观察到的最少细胞数为103个，且标记细胞数量和MRI扫描信号呈一定的相关性，可以用MRI信号的强弱初步反映标记细胞的数量。标记细胞中信号随时间的延长而逐渐增加，说明Sinerem标记后细胞中的铁含量随细胞分裂、代谢等逐渐减少。本文证实在体外情况下，Sinerem标记BMSCs-D-NSCs可以行MRI扫描进行示踪和定位。

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ExperimentalstudyonUSPIOlabelingofratBMSCs-D-NSCswithMRIinvitro

YANGZhijun,BAIMiaochun,CHENZhongcan,DAIYiwu,XURuxiang

DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,Beijing100700, China

ObjectiveTo observe magnetic resonance imaging (MRI) of rat bone marrow stromal cells derived from neural stem cells (BMSCs-D-NSCs) labeled by Sinerem in vitro and evaluate the feasibility of MRI tracking of labeled NSCs.MethodsThe bone marrow stromal cells (BMSCs) were isolated and induced into BMSCs-D-NSCs in vitro. A total of 105 cells labeled with 200 μg/ml Sinerem were immerged in 2% gel and scanned by different spin-echo sequence (SE) T1WI,T2WI and T2*WI respectively to determine the best scanning sequence with 4.7T MRI system. A total of 106 cells labeled with different concentration (0, 25, 50, 100, 200, 500 μg/ml) were scanned in 2% gel by T2*WI sequence. Different number (101,102,103,104,105) of BMSs-D-NSCs labeled with 200 μg/ml Sinerem were scanned to determine the threshold of cell quantity. In the end, the signal change of 200 μg/ml Sinerem labeled cells was observed at different time points.ResultsMRI result indicated that T2*WI was the most sensitive sequence. The MRI signal intensity of Sinerem labeled cells with different concentration was various, which decreased progressively with the increasing of Sinerem concentration. The signal intensity was lowest when the concentration was 500 μg/ml. The MRI signal intensity of more than 100 μg/ml Sinerem labeling cells was much lower than control sample and could be distinguished. The MRI signal change could be observed when the cell number was 103 or more. The signal intensity of 106 labeled cells was increasing with the time extending, which could still be displayed as different low signal for 4 w.ConclusionSinerem labeled BMSCs-D-NSCs in vitro appeared visually low signal area. The best sensitive sequence was T2*WI. The level of signal can be applied for evaluating cell numbers. Sinerem labeled cells can be tracked for a long time.

Neural stem cells; Bone marrow stromal cells; Magnetic resonance imaging; Ultrasmall superparamagnetic iron oxide; Sinerem

1671-2897(2016)15-226-04

·论著·

R 329.28

A

国家自然科学基金资助项目(81271316)

杨志军，副主任医师，医学博士，E-mail：zhijunyangfmmu@163.com

*通讯作者：徐如祥，教授，E-mail： zjxuruxiang@163.com

2015-04-22；

2015-05-13)