尼罗罗非鱼spo11基因的克隆表达及RU486处理对其表达的影响

尚婉婧 罗 凤 罗廷文 穆利容 胡重江 王志坚 周林燕

研究简报

尼罗罗非鱼spo11基因的克隆表达及RU486处理对其表达的影响

尚婉婧 罗 凤 罗廷文 穆利容 胡重江 王志坚 周林燕

（西南大学教育部淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室， 重庆市水产科学重点实验室， 重庆 400715）

Spo11 ［SPO11 meiotic protein covalently bound to DSB homolog （S. cerevisiae）］是减数分裂染色体重组过程中的重要蛋白， 参与DNA双链断裂复合物（Double-Strand breaks， DSBs）的形成。目前已经从几种脊椎动物中克隆出了spo11 基因， 表明Spo11可能在所有真核生物减数分裂过程中都具有保守的功能［1，2］。最新研究表明， 日本鳗鲡 （Anguilla japonica） spo11基因仅在精子发生过程前期的精母细胞有表达， 而在卵黄发生早期却没有检测到spo11的表达［2］。尽管研究者们普遍认为spo11是检测减数分裂的分子标记， 但该基因在硬骨鱼类的表达模式并非完全保守， 也未见关于spo11在硬骨鱼类个体发生过程中表达的报道。

传统观点认为， 配子成熟诱导激素（17α， 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one， 17α， 20β-DP， DHP）是硬骨鱼类的孕激素， 并且仅在卵子成熟时期的体细胞中合成， 而最近日本的一个研究小组通过离体实验发现， DHP在精子发生和卵巢分化早期也可能发挥重要作用［3］。RU486（米非司酮， Mifestone， Mifepristone）是一种人工合成的抗孕激素药物， 主要在受体水平竞争性拮抗孕激素的活性发挥作用。已有研究表明， 低剂量RU486的处理导致斑马鱼（Danio rerio）雄激素受体， 孕激素受体和相关类固醇合成酶基因的表达下调［4］。前期研究表明， 在XY雄性罗非鱼中， RU486处理导致DHP信号通路的阻遏， 进而阻滞生殖细胞的有丝分裂和减数分裂启动过程， spo11基因的表达显著下降， 最终影响产精量和子一代受精率［5］。为了进一步揭示spo11基因在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）减数分裂过程中的表达模式， 并阐明DHP在硬骨鱼类生殖细胞减数分裂早期是否发挥作用， 我们克隆得到spo11基因的cDNA序列， 并通过实时定量PCR和原位杂交等实验研究该基因在雌性个体性腺发育不同时期的表达模式。尝试通过RU486处理XX雌鱼， 选取spo11作为关键标志基因， 检测DHP对卵母细胞减数分裂过程的影响， 进而验证spo11基因在减数分裂过程中重要作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料和药物处理

罗非鱼在26℃循环水和10—14h光周期的条件下驯养。为了获得单性鱼苗， 我们用正常雌鱼分别与XX性逆转雄鱼和YY超雄鱼交配， 从而获得雌性（XX）和雄性（XY）的单性鱼苗。按RU486 50 mg/kg剂量将药物溶于无水乙醇后混入相应重量的饵料， 混匀、37℃烘干备用。用RU486处理孵化后5d的雌性尼罗罗非鱼， 持续处理3个月， 同时用只混有酒精的正常饲料饲养的XX雌性群体作为对照组。通过RT-PCR检测spo11基因表达情况， 通过HE染色观察性腺组织学形态变化。

1.2 罗非鱼spo11基因的克隆

首先， 从罗非鱼性腺转录组中分离出spo11基因的mRNA序列， 然后设计基因特异性引物（F1: 5′-ATG GAATCCCGTGCGGCTCA-3′； R1: 5′-CTAGTAC CACTCTTCAGGCTTCA-3′）， 用性腺cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件为: 94℃ 3min， 94℃ 30s， 60℃30s， 72℃ 30s， 35个循环后， 延伸10min。扩增产物经纯化回收后连入pMD19-T载体（TaKaRa）， 经蓝白斑筛选和菌落PCR筛选阳性克隆， 由上海英骏生物技术公司完成DNA测序。

1.3 Spo11序列分析与系统进化树的构建

根据克隆获得的罗非鱼的spo11， 应用DNAStar和Clustal X软件推导氨基酸序列并进行多重序列对比分析。通过Clustal X用于构建NJ系统进化树， 结果用Treeview软件显示。进化树中的数值表示随机进行1000次计算的步展值（Bootstrap value）， 代表该进化树的可靠性。所用其他物种的spo11序列均从GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载。其序列号为: 人（Homo sapiens）（AF169385_1）、小鼠（Homo sapiens）（AF165313_1）、鸡（Gallus gallus） （XP_001232076.2）、非洲爪蟾（Xenopus laevis） （NP_001008200.1）、青鳉（Oryzias latipes） （XP_004070604.1）、绿河鲀（Tetraodon nigroviridis） （CAG04090.1）、斑马鱼（NM_205682）、日本鳗鲡（BAM16279.1）和果蝇 （Drosophila melanogaster）（XP_002082235.1）。用小鼠DNA topoisomeraseⅠ（NP_082680）做外类群。

1.4 总 RNA 的提取及 cDNA 的合成

按TakaRaRNAiso plus说明书提取性腺总RNA， 并通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和纯度， 保证其A260/A280在1.8—2.0。按照TaKaRaPrime-Script™RT reagent Kit with gDNA Eraser操作说明书合成cDNA第一链。

1.5 Spo11 组织分布

运用qPCR的方法研究尼罗罗非鱼spo11基因的组织表达情况。分别选取性成熟时期罗非鱼（8月龄）解剖取其脑、肝脏、肠、性腺、肾脏、垂体、鳃、心脏、脾脏、肌肉和头肾等组织， 按照1.4所述的方法进行RNA分离和cDNA合成。然后按照SYBR Primix Ex TaqTMⅡ说明书进行qPCR。以β-actin作为内参， 内参引物为β-actin-F （5′-GGCATCACACCTTCTACAACGA-3′）和 β-actin-R（5′-ACGCTCTGT CAGGATCTTCA-3′），目的基因引物为spo11-qF （5′-CGAGAAGGATGCGACGTTCCAGAG-3′）和spo11-qR （5′-GAGCGTCCTTGGGAACCCGC-3′）。为保证real-time PCR的可靠性， 每种组织进行3个不同罗非鱼性腺的平行重复， 用目的基因除以内参基因拷贝数的平均值±SE， 表示spo11在该组织的mRNA表达水平。然后使用SPSS18.0软件对数据进行差异显著性分析， 最后利用Origin Pro 8和Adobe Illustrator CS6作图。

1.6 个体发生过程原位杂交（in situ hybridization， ISH）和实时定量qPCR

将去除卵黄和内脏的孵化后（Day after hatching，dah）10d、20d、40d和60d幼鱼全鱼， 及5个月罗非鱼性腺使用4%多聚甲醛（Nacalaitesque， Kyoto， Japan）固定， 然后石蜡包埋， 切片。ISH的具体过程按照已发表文章中的操作步骤进行［6］。 用含有spo11的pGEM-T Easy质粒为模板， 按照罗氏试剂盒（Roche Diagnostics GmbH， Mannheim， Germany）说明书合成地高辛标记的spo11探针。同时， 我们也分别分离孵化后10d、20d、30d、60d和70d雌雄个体性腺， 并且在每个检测时间点收集3个平行样品， 而每个样品包括50—100幼鱼性腺（孵化后5个月每个样品只包括一尾鱼的性腺）， 然后按照1.4和1.5中所述的方法进行RNA分离， cDNA逆转录和qPCR和数据统计分析。

1.7 反转录PCR和组织学观察

用RU486从孵化后5d至孵化后3个月处理XX罗非鱼， 分别取对照组和处理组罗非鱼性腺， 在波恩氏液中固定， 石蜡包埋， 切片。使用常规HE染色步骤来观察处理后性腺表型的变化， 用Zeiss显微成像系统观察、照相。运用RT-PCR的方法检测RU486处理组和对照组罗非鱼spo11基因的组织表达差异。选取处理3个月后罗非鱼的性腺组织， 按照1.4所述的方法进行RNA分离和cDNA合成。然后作为模板进行RT-PCR扩增。RT-PCR过程简述如下: 94℃ 3min， （94℃ 15s， 61℃ 30s， 72℃ 30s）×28个循环， 72℃ 5min。PCR产物跑聚丙烯酰胺凝胶电泳， 以 βactin作为内参。分析处理组和对照组条带位置及亮度。

2 结果

2.1 罗非鱼Spo11序列分析和进化树分析

克隆得到的罗非鱼Spo11序列为1468 bp， 其中5′端非编码区（Untranslated region， UTR）57 bp， 3′端UTR 239 bp，ORF为1173 bp， 编码390个氨基酸（Genbank序 列号: XP_003439029）。通过多重序列对比发现， 罗非鱼Spo11氨基酸序列与鱼类和其他脊椎动物spo11都表现出较高的相似性。系统进化分析表明（图 1）， 罗非鱼spo11与其他硬骨鱼类spo11聚于一枝， 脊椎动物spo11按照其进化地位严格聚类。

图 1 脊椎动物的spo11序列的进化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of vertebrates’ spo11

2.2 罗非鱼spo11 mRNA的组织表达模式

采用Real-time PCR方法研究了spo11 mRNA在成体罗非鱼（8月龄）各组织的表达模式， 结果表明罗非鱼spo11 mRNA特异性地在雌雄成鱼性腺表达， 且在精巢中的表达量远远高于卵巢（图 2）。相反， 在其他组织没有发现spo11 mRNA的表达。

2.3 原位杂交分析罗非鱼spo11 mRNA的个体发生

通过原位杂交实验研究了spo11 mRNA在孵化后10d到5个月罗非鱼性腺中表达水平， 结果表明罗非鱼spo11在孵化后10d的雌性性腺中的卵原细胞已经开始有表达（图 3A、B）， 然后持续在减数分裂细胞的细胞质中大量表达（图 3C、D）， 在5个月罗非鱼性腺的I、II时相卵母细胞中的细胞质中呈现高水平表达（图 3D、E）。而在雄性罗非鱼性腺中， spo11 mRNA从孵化50d才开始表达（图 3I 、J）， 并且在孵化后5个月的罗非鱼精巢中的精母细胞有明显表达（图 3J）。

为了进一步验证spo11在个体发生过程中雌雄性腺的表达情况， 我们通过Real-time PCR比较研究了该基因在孵化后5—70d雌雄性的表达水平（图 4）。结果显示， 在孵化后30d的雌性性腺中， spo11 mRNA的表达水平迅速上调， 并且呈现逐渐上升趋势。相反在雄性性腺， spo11 mRNA的表达从孵化后50d才开始迅速上升。

2.4 RU486处理罗非鱼后性腺组织学分析和spo11基因的表达变化

在组织学水平上， 发现DHP受体拮抗剂（RU486）能够诱导XX罗非鱼性腺表现为体细胞大量增生， 减数分裂过程被抑制， 卵母细胞退化消失等（图 5B）， 而在有些XX罗非鱼性腺， 整个性腺充满体细胞， 未见卵子发生和减数分裂过程（图 5C）。在正常XX罗非鱼性腺， 可见减数分裂不同时期的卵母细胞（图 5A）。通过RT-PCR研究RU486持续处理罗非鱼3个月后 spo11基因的变化， 结果表明处理后的spo11低水平表达甚至检测不到表达量， 并且明显低于XX正常个体的表达水平（图 6）。

3 讨论

本实验在尼罗罗非鱼分离得到的spo11基因和其他物种的spo11基因序列具有较高的相似性， 表明罗非鱼spo11可能具有其他物种spo11的功能， 促进罗非鱼生殖细胞减数分裂的起始。在脊椎动物spo11系统进化树中，罗非鱼跟其他硬骨鱼类spo11聚集于一个进化枝上。总之通过序列多重对比分析和进化树分析， 我们认为在罗非鱼克隆的spo11基因是真正的spo11。

图 2 Real-time PCR分析 Spo11 mRNA在罗非鱼雌雄成鱼各组织的表达Fig. 2 Real-time PCR analysis of spo11 mRNA expression in various tissuses of adult Nile tilapia

本研究通过qPCR分析了spo11在成体各个组织的表达水平， 发现该基因在性腺特异地表达， 而在其他组织没有检测到该基因的表达。本研究结果跟spo11基因在人类， 小鼠和日本鳗鲡不一致。已有的研究表明， 人类和小鼠spo11基因在性腺和其他组织， 包括肺、肌肉、精巢、卵巢、胸腺等组织都有明显表达［7］。通过原位杂交实验我们检测到罗非鱼spo11基因在5个月雌雄性腺呈现高水平表达， 在卵巢的表达主要集中在卵母细胞的细胞质， 而在精巢中主要表达于精母细胞。不同的是， 日本鳗鲡spo11仅在精子发生过程的精母细胞细胞表达， 而在卵子发生过程的卵黄生成早期却检测不到该基因的表达。总之， 本结果表明， 跟上述物种相比， 罗非鱼spo11适合作为雌雄性腺分化早期生殖细胞减数分裂的标志基因。

图 3 孵化后10d 到 5个月罗非鱼的性腺中 spo11 mRNA表达的原位杂交分析Fig. 3 Ontogenic expression of tilapia Spo11 in the tilapia gonads from 10 dah to 5 month old fish was analyzed by in situ hybridization

图 4 实时定量PCR检测罗非鱼个体发生过程中 spo11的表达情况Fig. 4 Ontogenic expression profile of spo11 by real-time RTPCR in tilapia

众所周知， 雌性生殖细胞进入减数分裂的时间明显早于雄性， 在罗非鱼， 雌性个体减数分裂开始于20d左右，而雄性个体减数分裂起始时间推迟到50d左右［8］。本研究的Real-time PCR和原位杂交结果表明， 尼罗罗非鱼spo11在雌性的性腺的表达开始于孵化后10d左右， 而在雄性推迟到50d左右， 这种雌性差异表达的模式跟雌雄个体减数分裂起始时间相吻合， 这也进一步证明罗非鱼spo11基因表达模式与罗非鱼减数分裂启动的模式一致，因此可以作为研究罗非鱼性腺分化早期生殖细胞减数分裂过程的标志基因。另外， 我们发现在性腺分化早期， 因为雌性生殖细胞早于雄性进入减数分裂过程， spo11在XX个体性腺的表达水平高于XY个体。而雄鱼一旦进入减数分裂过程， 我们推测可能是因为雄性性腺中精子发生这一减数分裂过程非常旺盛， 因此spo11基因的表达量就远远超过雌鱼。这跟本课题组的性腺转录组测序中的结果吻合［9］。

进一步通过药物RU486处理XX罗非鱼， 性腺组织学观察发现， RU486处理导致卵母细胞退化， 甚至完全消失。同时发现RU486处理后的spo11基因表达量明显减少， 我们推测RU486处理影响了罗非鱼生殖细胞的减数分裂过程， 即卵子发生过程。而这种影响必将导致雌性罗非鱼的产卵量和卵子的质量降低， 以及受精率和后代成活率。

总之， 本研究成功克隆出罗非鱼的spo11基因， 其特异性地在成体性腺表达， 并发现其在雌性生殖细胞中的表达明显早于雄性。因此本研究认为spo11基因在罗非鱼生殖细胞减数分裂过程发挥重要作用， 目前正在通过TALEN基因敲除技术， 拟进一步深入研究其在性腺分化过程中的具体功能。另外， 本研究推测RU486作为一种环境内分泌干扰物质的污染， 长期暴露可能导致鱼类减数分裂过程紊乱， 进而将严重影响鱼类的生殖力， 而可以通过spo11基因的表达变化， 检测RU486对雌雄罗非鱼生殖细胞分化过程的影响。

图 5 DHP受体拮抗剂（RU486）从孵化后5d处理3个月对XX个体性腺分化的影响Fig. 5 Morphological observation of gonad in xx fish treated with DHP receptor antagonist （RU486） for three months

图 6 RT-PCR检测RU486处理后雌性罗非鱼 spo11基因的表达变化Fig. 6 RT-PCR analysis of the expression changes of spo11 in the control and RU486-treated XX tilapia

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF SPO11 GENE AND EXPRESSION CHANGE UNDER RU486 TREATMENT IN NILE TILAPIA

SHANG Wan-Jing， LUO Feng， LUO Ting-Wen， MU Li-Rong， HU Chong-Jiang， WANG Zhi-Jian and ZHOU Lin-Yan
（Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development （Ministry of Education）， Key Laboratory of Aquatic Science of Chongqing， Southwest University， Chongqing 400715， China）

罗非鱼； spo11基因； 克隆和表达； 组织分布； 个体发生； RU486

Nile tilapia； spo11； Molecular cloning and expression analysis； Tissue distribution； Ontogeny；RU486

10.7541/2016.53

Q344+.1

A

1000-3207（2016）02-0403-05

2015-03-20；

2015-08-15

国家级大学生创新训练项目（201310635001）； 西南大学本科生科技创新基金项目（1221002）资助 ［Supported by National Students’ innovation and entrepreneurship training program （201310635001）； Southwest University Science and technology innovation foundation for Undergraduate （1221002）］

尚婉婧（1992—）， 女， 四川攀枝花人； 本科； 研究方向为生物工程。E-mail: wanjingshang@yahoo.com

周林燕， E-mail: yanlinzhou916@126.com； 王志坚， E-mail: wangzj@swu.edu.cn