应用ELISA方法检测牛结核分枝杆菌Y-干扰素

黄世品，吴志鹏，梁勇

（广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞523086）

应用ELISA方法检测牛结核分枝杆菌Y-干扰素

黄世品，吴志鹏，梁勇

（广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞523086）

为了验证ELISA方法检测牛结核分枝杆菌Y-干扰素的可行性，应用建立的ELISA方法检测30份牛全血，结果为阴性和阳性对照均成立，30份全血的牛结核分枝杆菌Y-干扰素均为阴性，结果表明应用ELISA方法检测牛结核分枝杆菌Y-干扰素诊断牛结核分枝杆菌可行，可以适用于牛结核分枝杆菌的大规模监测。

结核分枝杆菌；牛；ELISA；Y-干扰素；血清学

结核（tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的一种重要的人畜共患病在世界各国均有发生，对畜牧业的发展和人类的健康具有很大的威胁。结核病在动物检疫中具有很重要的意义，目前我国牛结核病的检疫方法主要是牛结核菌素皮内变态反应，该方法存在费事，受外界干扰因素多等缺点。1989年Wood等建立了一种简单的体外检测方法，其原理是基于血液T淋巴细胞对牛结核分枝杆菌PPD的细胞免疫反应。结核菌素PPD抗原递呈到全血组织培养物的淋巴细胞后，感染牛结核分支杆菌的细胞就能产生Y-干扰素，并通过基于单克隆抗体夹心ELISA检测到。未感染牛结核分枝杆菌的淋巴细胞不会产生Y-干扰素，因此，Y-干扰素的检测与牛结核分枝杆菌感染相关。目前，体外Y-干扰素的检测方法已被澳大利亚、新西兰和欧美等国家批准为正式试验方法，并且为OIE推荐的方法。本次研究利用建立Y-干扰素ELISA检测方法，检测活牛交易市场的牛，验证该方法的可行性，为牛结核的检疫和流行病学监测提供依据，现报告如下。

1　材料与方法

1.1牛全血30份牛全血，采自东莞市横沥镇活牛交易市场，用颈静脉采血，加入肝素抗凝剂，颠倒几次混匀血液，使肝素溶解。在室温下运送到实验室，并在30h内进行培养。

1.2试剂和仪器牛结核分枝杆菌Y-干扰素试剂盒：购自瑞士BOVIGAM，批号：6332900701；牛型结核菌素，购自BOVIGAM，批号：63314017001；禽型结核菌素，购自BOVIGAM，批号：6331301701。SUNRISE酶标仪购自TECAN公司。

1.3方法

1.3.1全血培养将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加3管1.5mL分装的抗凝血，分别无菌加入100μLPBS（阴性抗原对照）、禽型PPD、牛型PPD至相应的孔，用微量振荡器震荡1min，放在湿盒37℃培养16～24h。

1.3.2血浆样品的收集孵育后小心吸取约500mL的上层血浆放入储存管中，待检，尽量避免吸入红细胞。

1.3.3ELISA方法

1.3.3.1使用前，所有的试剂组分回复到室温（21℃+/-5℃），加入50μL稀释液至所需的孔，加入50μL待测样品和阴性、阳性对照至相应的孔，震荡混匀，室温孵育60min。

1.3.3.2倒掉板中液体室温洗涤6次，排干，加入100μL配制的酶标结合物，室温孵育60min。

1.3.3.3倒掉板中液体室温洗涤6次，排干，加入100μL底物，室温避光孵育30min。

1.3.3.4加入50μL终止液，450nm波长读数。

1.3.3.5结果有效性。

牛Y-干扰素阴性对照小于0.13，重复孔差值不能大于0.04；牛Y-干扰素阳性对照大于0.7，重复孔OD值变化幅度不超过平均OD值得30%，结果成立。

1.3.3.6结果判定。

牛PPD的OD值减去阴性抗原的OD值大于等于0.1且牛PPD的OD值减禽PPD的OD值大于等于0.1判为阳性。牛PPD的OD值减去阴性抗原的OD值小于0.1或牛PPD 的OD值减禽PPD的OD值小于0.1判为阴性。

2　结果

结果为阳性对照平均OD值为1.02，阴性对照平均OD值为0.02，结果成立，检测30份牛全血，牛结核分枝杆菌结果均为阴性，详细结果见表1。

3　讨论

本次试验采用建立的Y-干扰素ELISA检测方法，试验结果成立，对采自活牛交易市场的30头牛检测结果均为阴性，结果表明该方法可行，适用于基层兽医实验室的检测，活牛交易市场的牛未发现有结核病阳性可能与采集的样品比较少有关，在以后试验加大样品的检测量。

牛结核病的诊断方法目前主要有三类：细菌分离培养鉴定、免疫学方法和细菌的核酸检测。其中细菌分离培养鉴定是结核杆菌的确诊方法，但是分枝杆菌生长缓慢，培养时间长，细菌分离率低，需要在一定生物安全防护措施的实验室才能操作，并且需要采集组织样品，不适合活牛的检疫。细菌的核酸检测，灵敏度高，特异性好，需要PCR仪或荧光PCR仪，不利于基层的检疫。在我国的结核病检疫中主要采用牛结核菌素皮内变态反应，但该方法存在较多假阳性，需进行现场检测，试验需要3d时间，受外界的干扰因素比较多，对操作人员要求也比较高，需要一定的检疫经验。采用牛体外Y-干扰素来判断牛结核的感染，敏感性和特异性均高于皮内变态反应。体外Y-干扰素检测方法与颈部皮试变态反应相比,可以排除一部分禽结核阳性的牛,特异性高，在牛结核病诊断中，除了常规皮试变态反应,体外Y-干扰素来判断牛结核是最有应用价值和前景的检测方法。

表1　牛分枝杆菌检测结果

应用Y-干扰素检测方法进行牛结核病的检疫，不但可以提高牛结核分枝杆菌检测的准确性，还可以提高检测的速度。在实际的临床应用中，可以把皮内变态反应和体外Y-干扰素检测方法结合起来。在对牛进行牛结核检疫时，先采用皮内变态反应检测，检测结果为阳性的牛即采取隔离措施，然后采用Y-干扰素检测方法进一步检测，两种检测方法均为阳性的牛给予淘汰，养殖场经过多次的淘汰，最终达到牛结核病的净化目的。

[1]刘思国，等.牛结核病研究进展[J].畜牧兽医科技信息，2003，10：10-14.

[2]Wood P R，et al.Development of a simple,rapid in vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of gamma interferon[J].Res Vet Sic，1990，49:46-49.

[3]Michel Denis D，et al.Enhancement of the sensitivity of the whole-blood gamma interferon assay for diagnosis of Mycobacterium bovis infections in cattle[J].Clin Vaccine Immunol，2007，14(11): 1483-1489.

[4]Wood P R，et al.Field comparison of the interferon-gamma assay and the intradermal tuberculin test forthe diagnosis of Bovine tuberculosis[J].Aust Vet J，1991，68:286-290.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．10.022