锦鲤疱疹病毒病的诊断与防控

李玉平，毛洪顺，唐绍林，翟秀梅，马家好

（1.黑龙江生物科技职业学院水产技术与环境工程系，黑龙江哈尔滨150025；2.广东省广州利洋水产科技股份有限公司，广东广州510510）

锦鲤疱疹病毒病的诊断与防控

李玉平1，毛洪顺1，唐绍林2，翟秀梅1，马家好2

（1.黑龙江生物科技职业学院水产技术与环境工程系，黑龙江哈尔滨150025；2.广东省广州利洋水产科技股份有限公司，广东广州510510）

锦鲤疱疹病毒病是危害黑龙江省鲤鱼养殖业发展的疾病之一，目前本病无有效地治疗方法，只能及早诊断，做好疾病的预防和控制工作。本文就锦鲤疱疹病毒病的诊断方法和防控措施进行简要介绍。

锦鲤疱疹病毒病（Koi herpes virus disease，KHVD），是严重威胁鲤和锦鲤养殖业安全的一种世界性疾病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的疾病，我国将其列为二类动物疫病。病原为异样疱疹病毒科，鲤病毒属，锦鲤疱疹病毒（Koi herpes virus，KHV）。KHV主要感染鲤和锦鲤，其鱼苗、幼鱼、成鱼阶段均可感染，但幼鱼比成鱼更易感染KHV。鲤疱疹病毒病来势凶猛，传染快，死亡率高，且无有效治疗方法，给鲤鱼养殖业带来严重的经济损失，极大地影响了水产养殖者的养殖积极性。

由于该病毒造成病鱼的死亡率极高，疫情难以控制，已引起国内水产养殖业的高度关注。黑龙江省是鲤鱼养殖大省，以鲤鱼为代表的鲤科鱼类年产量占淡水养殖总产量的70%以上。为了进一步做好黑龙江省鲤疱疹病毒病的病害防控工作，保障我省水产养殖业持续健康发展，本文将介绍鲤疱疹病毒病的诊断方法和防控措施，并对该病防控技术进行应用及推广。

1　临床症状及病理变化初诊

患病鱼无力、无食欲，游动姿势异常，鱼体皮肤上常有苍白的大小不等的块斑及水泡，鳍条充血，鳃出血（要与大红鳃进行鉴别诊断）并产生大量粘液。

2　流行病学特点

锦鲤疱疹病毒仅感染鲤、锦鲤，该病发病温度18～30℃，最适水温是23～28℃,死亡率高达80%～100%。低于18℃，高于30℃不会引起死亡。

3　PCR诊断

目前，PCR诊断方法是锦鲤疱疹病毒病最准确的诊断方法，相关试剂和步骤（参照SN/T 1674-2011）如下：

3.1仪器与试剂

（1）仪器：PCR仪（晶格T960），电泳仪电源、电泳仪、紫外仪（北京六一）

（2）试剂：dNTP、Buffer、DNA聚合酶等（购自大连宝生物公司）

引物的设计与合成：KHV-R（292bp）:5’-GACACCACATCTGCAAGGAG-3’KHV-F（292bp）:5’-GACACATGTTACAATGGTCGC-3’

3.2操作步骤

（1）采样：采集肾脏、脾脏进行病毒PCR检测

（2）DNA抽提：将待检样品与灭菌生理盐水混合匀浆（1/10），取100μL组织匀浆加到有500μL组织裂解液的1.5mL离心管中，65℃处理1h，加入20μL蛋白酶K （20mg/mL），55℃孵育30min，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡混匀，静置20s，13500r/min，4℃离心3min，取上清液移入另一离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，静置20s，10000r/min，4℃离心15min。

取上清液（约600μL）到新的离心管中，加入1.5倍体积(约900μL)，-20℃预冷无水乙醇混匀，静置20℃过夜，15000r/min，4℃离心5min，弃上清液，加入500μL的70%乙醇，轻轻漂洗DNA沉淀2遍，弃上清液，吸水纸去除残余的乙醇，自然干燥10min，加50μL双蒸水溶解沉淀，-20℃保存。

（3）PCR扩增：100μL体系：10X缓冲液10μL，氯化镁10μL，dNTP 2μL，引物（40pmol）各2.5μL，Taq酶5μL，模板10μL，加水到100μL。94℃预变性5min，95℃1min，63℃1min，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

（4）琼脂糖凝胶板制备和电泳：制备1%琼脂糖凝胶，EB终浓度0.5-1μg/mL，100V电泳约20min，紫外仪观察。

结果：扩增292bp片段（见图1）

图1　PCR产物电泳结果292bp

4　防控

4.1调控好水质和底质，定期用微生态制剂全池泼洒进行水质调控，用氧化型改底制剂进行池塘底质改良，减少病原体大量繁殖的机率。

4.2疾病高发期，10～15d进行一次水体消毒，用二氧化氯按100～125g每亩水深1m全池泼洒。

4.3水体消毒3～5d后，使用1次有益菌类水质改良剂，按200～300g每亩水深1m全池泼洒。

4.4在发病高峰期以1个疗程5～7d，在饲料中每天按0.25g/kg·bw添加三黄散和0.2g/kg·bw大黄与板蓝根合剂投喂，间隔15d后，再投喂1个疗程。

5　讨论

锦鲤疱疹病毒病具有高度传染性，给鲤和锦鲤的养殖业造成极大经济损失，是OIE必须申报的疾病之一，PCR是目前检测锦鲤疱疹病毒最常用的方法，据资料报道，LAMP扩增法诊断锦鲤疱疹病毒具有方便、快速、准确等优点，但还未在基层推广应用。该病以预防为主，最有效的预防方法是疫苗免疫，组织浆疫苗安全但免疫效果不理想，弱毒疫苗免疫效果好，但存在毒力返强或散毒的风险，因此，结合目前现状，做好水质底质调控，提高鱼体抵抗力，是防控该病的有效措施，从而减少疾病发生，降低经济损失，以保证锦鲤和鲤鱼养殖业的健康发展。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．10.024

黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助，项目编号：12535118