HPLC法同时测定疏表灵颗粒中绿原酸、橙皮苷、黄芩苷的含量

李　昂，阚红玉，张　囡（.天津市儿童医院，天津　30034；.天士力制药集团股份有限公司，天津30093）

HPLC法同时测定疏表灵颗粒中绿原酸、橙皮苷、黄芩苷的含量

李昂1＊，阚红玉2，张囡1（1.天津市儿童医院，天津300134；2.天士力制药集团股份有限公司，天津300193）

目的：建立同时测定疏表灵颗粒中绿原酸、橙皮苷、黄芩苷含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为SAGA Tri-Sal C18，流动相为乙腈-0.5%磷酸（梯度洗脱），流速为1.0 ml/min，检测波长为320 nm，柱温为30℃，进样量为10 μl。结果：绿原酸、橙皮苷、黄芩苷的检测质量浓度线性范围分别为2.463～240.5 μg/ml（r=0.999 9）、6.577～642.3 μg/ml（r=0.999 8）、1.708～166.8 μg/ml（r=0.999 8）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤1.8%；加样回收率分别为97.02%～102.40%（RSD=1.9%，n=6）、96.55%～100.20%（RSD=1.6%，n=6）、97.51%～100.70%（RSD=1.2%，n=6）。结论：该方法操作简便，结果准确、灵敏度高、重复性好，可用于疏表灵颗粒中绿原酸、橙皮苷、黄芩苷含量的同时测定。

疏表灵颗粒；绿原酸；橙皮苷；黄芩苷；高效液相色谱法

疏表灵颗粒由淡豆豉、天花粉、陈皮、金银花、玄参、白茅根、黄芩等20种药味组成，具有散风解表、解肌透疹、清热解毒的作用，适用于小儿呼吸道感染、流感、麻疹、风疹、幼儿急疹等，临床应用广泛，疗效显著［1］。疏表灵颗粒为天津市儿童医院的院内制剂，其质量标准采用天津市卫生和计划生育委员会批准的院内制剂标准，标准中不包括含量测定项。为更有效地控制疏表灵颗粒的内在质量，本试验通过参考相关文献［2-5］，选取绿原酸、橙皮苷、黄芩苷3种成分作为质量控制指标，建立了同时测定3种成分含量的高效液相色谱法（HPLC），并进行了方法学验证。

1　材料

1.1仪器

LC20A系统，包含紫外双波长检测器、自动进样器、柱温箱、LC solution色谱工作站（日本岛津公司）；AX205十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；BP121S万分之一天平（德国塞多利斯公司）。

1.2药品与试剂

疏表灵颗粒（天津市儿童医院制剂室提供，批号：20150402、20150601）；绿原酸对照品（批号：110753-201314，纯度：96.3%）、橙皮苷对照品（批号：110721-201115，纯度：96.3%）、黄芩苷对照品（批号：110715-201318，纯度：93.3%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：SAGA Tri-Sal C18（150 mm×4.6 mm，3µm）；流动相：乙腈-0.5%磷酸，梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 ml/min；检测波长：320 nm；柱温：30℃；进样量：10 μl。

表1　梯度洗脱程序Tab 1　Gradient elution program

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液分别称取绿原酸、橙皮苷、黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇稀释溶解，制成每1 ml含绿原酸15.54 μg、橙皮苷41.44 μg、黄芩苷10.77 μg的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液取疏表灵颗粒约1.0 g，精密称定，置于100 ml锥形瓶中，加50%甲醇50 ml，密塞，称定质量，超声处理（功率：120 W，频率：40 kHz，下同）30 min，取出后放冷，加50%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液以缺金银花、陈皮、黄芩的原方，按样品制备工艺进行制备，得缺金银花、陈皮、黄芩的阴性制剂。取阴性制剂1 g，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.3系统适用性试验

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以绿原酸、橙皮苷、黄芩苷峰计均＞4 000；保留时间分别为14.208 min、30.003 min、33.315 min。阴性对照色谱图中绿原酸、橙皮苷、黄芩苷对应的保留时间处无其他色谱峰出现，表明其他成分对测定无干扰。

图1　高效液相色谱图A.混合对照品；B.阴性对照；C.供试品；1.绿原酸；2.橙皮苷；3.黄芩苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.negative control；C.test sample；1.chlorogenic acid；2.hesperidin；3.baicalin

2.4线性关系考察

在这一点的探讨上，笔者并不认为应放弃传统技法学习，只是在教学时，应更注重创作思维的培养，让学生为了完成想法而去主动学习技术，这样远比被动的技法训练，要有效而有意义得多。并且应鼓励学生大胆探索技法，不让他们框定在传统技术的语言、方式和材料的运用上。西方当代陶艺之所以发展迅速，也是因为他们在传统技法的基础上，尊重个体声音，大胆探索实验的结果。

精密称取绿原酸、橙皮苷、黄芩苷对照品适量，置于100 ml量瓶中，加50%甲醇稀释溶解，制成每1 ml含绿原酸242.8 μg/ml、橙皮苷647.5 μg/ml、黄芩苷168.3 μg/ml的混合对照品贮备液，再逐步稀释制成绿原酸质量浓度为240.5、96.20、38.48、15.39、6.157、2.463 μg/ml；橙皮苷质量浓度为642.3、256.9、102.8、41.11、16.44、6.577 μg/ml；黄芩苷质量浓度为166.8、66.72、26.69、10.68、4.270、1.708 μg/ml的系列对照品混合溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表2。

表2　回归方程与线性范围Tab 2　Regression equations and linear ranges

2.5精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μl，按照“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，绿原酸、橙皮苷、黄芩苷峰面积的RSD分别为1.6%、1.5%、1.1%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验

称取样品（批号：20150601）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、9、12、16、20、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸、橙皮苷、黄芩苷峰面积的RSD分别为1.5%、1.8%、1.5%（n= 9），表明供试品溶液在室温放置24 h稳定性良好。

2.7重复性试验

称取同一批样品（批号：20150601）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸、橙皮苷、黄芩苷的平均含量分别为0.748 8、1.957 9、0.433 9 mg/g，RSD分别为1.4%、1.2%、1.2%（n=6），表明本方法重复性较好。

2.8加样回收率试验

取同批样品6份（批号：20150601），每份约0.5 g，精密称定，置于100 ml锥形瓶中，分别加入绿原酸质量浓度为96.20 μg/ml、橙皮苷质量浓度为256.9 μg/ml、黄芩苷质量浓度为66.72 μg/ml的混合对照品溶液3.5 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

表3　加样回收率试验结果（n=6）Tab 3　Results of recovery tests（n=6）

表4　样品含量测定结果（n=2，mg/g）Tab 4　Results of contents determination of sample（n=2，mg/g）

2.9样品含量测定

取样品（批号：20150402、20150601）约1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分的含量，结果见表4。

3　讨论

3.1色谱条件的选择

3.1.1流动相考察参考2015版《中国药典》收载的金银花、陈皮、黄芩药材的流动相条件［6］，本试验考察了流动相为甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-水及乙腈-磷酸溶液4种系统。结果发现，在乙腈-磷酸溶液系统下，出峰最快。在此基础上，笔者又进一步考察了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%磷酸及乙腈-1%磷酸的色谱效果，结果发现在乙腈-0.5%磷酸条件下，色谱峰峰形最好。由此，确定本试验流动相为乙腈-0.5%磷酸。同时，笔者还对流动相的梯度洗脱比例进行了系统的考察优化，保证了绿原酸、橙皮苷、黄芩苷的分离度。

3.1.2检测波长的选择参考2015年版《中国药典》收载的金银花、陈皮、黄芩药材的检测波长［6］，并参照相关文献［7-9］，本试验最终确定检测波长为320 nm。

3.1.3色谱柱选择笔者比较了Agilent-ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）与SAGA Tri-Sal C18（4.6 mm×150 mm，3 µm）色谱柱的分离行为，在保证绿原酸、橙皮苷、黄芩苷分离度的基础上，后者出峰更快、时间更短。因此，最终选择SAGA Tri-Sal C18（4.6 mm×150 mm，3µm）为色谱柱。

3.2样品处理方法的选择

笔者比较了加热回流和超声处理两种方法。结果显示，超声法的提取效果与加热回流法相当，由于超声处理的操作更简单，因此本试验最终采用超声法处理样品。此外，笔者还对超声溶剂甲醇的质量分数（100%、70%、50%、30%）、溶剂用量（30 ml、50 ml、100 ml）以及超声时间（20 min、30 min、40 min）的提取效果进行了考察，最终确定采用50 ml 50%甲醇、超声提取30 min的样品处理条件。

综上所述，本方法操作简便，结果准确、灵敏度高、重复性好，可用于疏表灵颗粒中绿原酸、橙皮苷、黄芩苷的含量测定。

［1］刘丽，蒋志宏，褚婕.清降丸和疏表灵的体外抗菌活性试验［J］.职业与健康，2004，20（11）：135.

［2］姚帅，杨跃华，刘岩，等.RP-HPLC同时测定大卫颗粒中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、黄芩素和汉黄芩素的含量［J］.药物分析杂志，2012，32（7）：1 253.

［3］张囡，钱宇坤，李维超.病毒合剂（Ⅱ）中黄芩苷、绿原酸和橙皮苷的含量测定［J］.天津药学，2015，3：13.

［4］史宏妍，潘成学.HPLC法同时测定小儿热速清颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量［J］.中国药房，2012，23（16）：1 531.

［5］陈国宝，宋桂萍，杨弃尘.HPLC法同时测定双黄连片中黄芩苷、绿原酸、连翘苷、连翘酯苷的含量［J］.中国药房，2011，22（48）：4 594.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：233.

［7］钱星文，何雁，罗晓健，等.高效液相色谱法测定藿香正气制剂中橙皮苷的含量［J］.江西中医学院学报，2005，17（3）：38.

［8］杨宏静，方应权.高效液相色谱法测定五味消毒饮中绿原酸含量［J］.现代医药卫生，2014，30（1）：21.

［9］李运景，陈钧茂，张锦兴，等.HPLC测定清肺合剂中黄芩苷的含量［J］.药品评价，2007，4（4）：313.

（编辑：申琳琳）

Simultaneous Determination of ChlorogenicAcid，Hesperidin and Baicalin in Shubiaoling Granule by HPLC

LI Ang1，KAN Hongyu2，ZHANG Nan1（1.Tianjin Children's Hospital，Tianjin 300134，China；2.Tasly Parmaceutical Group Co.，Ltd.，Tianjin 300193，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of chlorogenic acid，hesperidin and baicalin in Shubiaoling granule.METHODS：HPLC was performed on the column of SAGA Tri-Sal C18with mobile phase of acetonitrile-0.5% phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 320 nm，column temperature was 30℃，injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 2.463-240.5 μg/ml for chlorogenic acid（r=0.999 9），6.577-642.3 μg/ml for hesperidin（r=0.999 8）and 1.708-166.8 μg/ml for baicalin（r=0.999 8）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no more than 1.8%；recoveries were 97.02%-102.40%（RSD=1.9%，n=6），96.55%-100.20%（RSD=1.6%，n=6）and 97.51%-100.70%（RSD=1.2%，n=6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate with high sensitivity and good reprosucibility，and can be used for the simultaneous determination of chlorogenic acid，hesperidin and baicalin in Shubiaoling granule.

Shubiaoling granule；Chlorogenic acid；Hesperidin；Baicalin；HPLC

R917

A

1001-0408（2016）27-3872-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.43

＊主管药师，硕士。研究方向：药物制剂。电话：022-87199759。E-mail：andyli100@sina.com

（2015-09-12

2016-08-04）