HPLC法同时测定跌打丸中芍药苷和丹皮酚的含量

窦红允，黄东杰，王孟阳，张　洁，王晓琦，田永庆（沧州市食品药品检验所，河北沧州　061001）

HPLC法同时测定跌打丸中芍药苷和丹皮酚的含量

窦红允＊，黄东杰，王孟阳，张洁，王晓琦，田永庆（沧州市食品药品检验所，河北沧州061001）

目的：建立同时测定跌打丸中芍药苷和丹皮酚含量的方法，为提高其质量控制标准提供参考。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为ZORBAX C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脱），流速为0.8 ml/min，检测波长为230 nm（芍药苷）、274 nm（丹皮酚），柱温为35℃，进样量为20 μl。结果：芍药苷和丹皮酚的检测进样量线性范围分别为0.514 8～1.544 5 μg（r=0.999 2）、0.643 2～1.960 4 μg（r=0.999 8）；定量限分别为0.135 6、0.126 4 μg、检测限分别为0.067 8、0.063 2 μg；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2%；加样回收率分别为95.78%～97.27%（RSD=0.62%，n=6）、97.38%～98.38%（RSD=0.42%，n=6）。结论：该方法操作简便、重复性好、灵敏度高，可用于同时测定跌打丸中芍药苷和丹皮酚的含量。

跌打丸；芍药苷；丹皮酚；含量测定；高效液相色谱法

跌打丸是2015年版《中国药典》（一部）收载的常用复方中药，由三七、赤芍、白芍、牡丹皮、血竭、骨碎补、乳香、没药、甘草等24味中药材组成，具有活血散瘀、消肿止血之功效，可用于跌打损伤、筋断骨折、淤血肿痛、闪腰岔气等证［1］。赤芍和白芍基源相近，主成分相同，现代药理学研究表明，赤芍和白芍具有抗炎、抗凝血、免疫调节等作用［2］，是跌打丸中起活血散瘀、消肿止血的重要药物。牡丹皮具有清热凉血、活血化瘀的功能［1］，是跌打丸中的有效成分之一。赤芍和白芍其主要活性成分为芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷等单萜类成分。牡丹皮主要含有丹皮酚等酚酸类成分和芍药苷等糖苷类成分［3］。在2015年版《中国药典》（一部）中只用血竭素高氯酸盐定量，考虑到芍药苷和丹皮酚是与跌打丸功效相关的重要活性成分，笔者参考相关文献［4-7］，采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定跌打丸中芍药苷和丹皮酚的含量，为提高其质量控制标准提供参考。

1　材料

1.1仪器

1260型HPLC仪，包括1260ALS自动进样器、1260VWD检测器、hp-5工作站（美国Agilent公司）；XS105DU型十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-300VED型双频数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司，功率：300 W，频率：45 kHz）。

1.2药品与试剂

跌打丸（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号：14010074、13012817、13012033，规格：3 g/丸）；芍药苷对照品（批号：110736-201337，纯度：94.9%）、丹皮酚对照品（批号：110708-200506，置五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h以上使用）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，乙醇为分析纯，水为超纯水。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：0.8 ml/min；检测波长：230 nm（芍药苷）、274 nm（丹皮酚）；柱温：35℃；进样量：20 μl。

表1　梯度洗脱程序Tab 1　gradient elution program

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液精密称取芍药苷对照品0.010 85 g、丹皮酚对照品0.010 12 g，分别置于50 ml量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，摇匀，制成质量浓度分别为0.217 0、0.202 4 mg/ml的单一对照品贮备液。分别精密量取上述芍药苷对照品贮备液25 ml、丹皮酚对照品贮备液5 ml，置于同一100 ml量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液取样品适量，剪碎，取约3.0 g，精密称定，置于100 ml具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 ml，精密称定，超声处理40 min，放冷，精密称定，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液按样品的处方比例和制备工艺分别制备不含白芍、赤芍、牡丹皮的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.3系统适用性与专属性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以芍药苷峰计为5 000；保留时间为12 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1　高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.芍药苷；2.丹皮酚Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference；B.test sample；C.negative control；1.paeoniflorin；2. paeonol

2.4线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0、10、15、20、25、30 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得芍药苷的回归方程为y=1.92x－52.25（r=0.999 2）、丹皮酚的回归方程为y=6.48x－5.80（r=0.999 8）。结果表明，芍药苷和丹皮酚的进样量线性范围分别为0.514 8～1.544 5、0.643 2～1.960 4 μg。

2.5定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得芍药苷和丹皮酚的定量限分别为0.135 6、0.126 4 μg；当信噪比为3∶1时，得芍药苷和丹皮酚的检测限分别为0.067 8、0.063 2 μg。

2.6精密度试验

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件重复进样测定6次，记录峰面积。结果，芍药苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.36%和0.57%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芍药苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为1.1%、1.2%（n=5），表明供试品溶液在室温下12 h内稳定性良好。

2.8重复性试验

取样品（批号：14010074）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样测定6次，记录峰面积。结果，芍药苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.64%、0.83%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：14010074）适量，共6份，每份约3.0 g，精密称定，精密加入芍药苷对照品3.34 mg、丹皮酚对照品5.82 mg，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果详见表2。

表2　加样回收率试验结果（n=6）Tab 2　Results of recovery tests（n=6）

2.10样品含量测定

取3批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法以峰面积计算样品中芍药苷和丹皮酚的含量，结果详见表3。

表3　样品含量测定结果（n=3，mg/g）Tab 3　Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3　讨论

3.1提取溶剂的选择

笔者通过查阅相关文献［3］，并根据待测成分的理化性质，对提取溶剂进行了考察和比较。结果发现，采用50%乙醇提取时色谱峰杂质较少，分离度更佳。因此，本试验选用50%乙醇为提取溶剂。

3.2流动相的选择

文献报道采用HPLC法测定中药复方制剂中芍药苷和丹皮酚的流动相系统有甲醇-1.5%冰乙酸［4］、甲醇-0.05%磷酸［5］、乙腈-0.1%磷酸［6-8］、乙腈-1%冰乙酸［9］、乙腈-水［10］、甲醇-水等，本试验比较了几种流动相的检测情况，结果以乙腈-0.1%磷酸为流动相时，样品中芍药苷和丹皮酚的色谱峰能达到基线分离，峰形良好，阴性对照无干扰；而采用其他流动相，样品分离度均不够理想。因此，本试验选用乙腈-0.1%磷酸为流动相。

综上所述，本方法操作简便、重复性好、灵敏度高，可用于同时测定跌打丸中芍药苷和丹皮酚的含量。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：1 590、172.

［2］杨琪伟，杨莉，熊爱珍，等.赤芍和白芍抗炎作用的UPLC-MS代谢组学初步研究［J］.中国中药杂志，2011，36（3）：694.

［3］孟庆焕，祖元刚，王化.牡丹种皮中芍药苷和丹皮酚的优化提取工艺［J］.安徽农业科学，2015，43（7）：68.

［4］赵佳丽，肖国栋，徐宏祥，等.HPLC法测定咽炎片中的黄芩苷、芍药苷和丹皮酚［J］.华西药学杂志，2014，29（4）：476.

［5］李向阳，屠万倩.HPLC法测定六味地黄丸中丹皮酚、芍药苷和乌苏酸［J］.中成药，2012，34（2）：277.

［6］毛晓敏，张晓波，陈小清，等.HPLC法测定十二乌鸡白凤丸中芍药苷、阿魏酸和丹皮酚含量［J］.中成药，2008，30（5）：678.

［7］冯发青，王恩源，伍庆，等.HPLC法同时测定麦味地黄胶囊中马钱苷、芍药苷和丹皮酚含量［J］.中成药，2012，34（12）：2 339.

［8］李智慧，吴素香，石森林，等.HPLC法测定不同厂家桂枝茯苓丸中丹皮酚及芍药苷［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（9）：121.

［9］徐灿辉，何维为，何云飞.HPLC法测定六味地黄胶囊毛蕊花糖苷、马钱苷和丹皮酚［J］.药物评价研究，2014，37（3）：257.

［10］杜蓉，张孟佑.HPLC法测定加味逍遥丸中芍药苷与甘草苷的含量［J］.中国药房，2015，26（18）：2 571.

（编辑：刘柳）

Simultaneous Determination of Paeoniflorin and Paeonol in Dieda Pill by HPLC

DOU Hongyun，HUANG Dongjie，WANG Mengyang，ZHANG Jie，WANG Xiaoqi，TIAN Yongqing（Cangzhou Institute for Drug and Food Control，Hebei Cangzhou 061001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of paeoniflorin and paeonol in Dirda pill，and provide reference for improving its quality control standard.METHODS：HPLC was performed on the column of ZORBAX C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elutio）at a flow rate of 0.8 ml/min，detection wavelength was 230 nm（paeoniflorin），274 nm（paeonol），columne temperature was 35℃，injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 0.514 8-1.544 5 μg for paeoniflorin（r=0.999 2）and 0.643 2-1.960 4 μg for paeonol（r=0.999 8）；the limits of quantification were 0.135 6，0.126 4 μg，limits of detection were 0.067 8，0.063 2 μg；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 95.78%-97.27%（RSD=0.62%，n=6）and 97.38%-98.38%（RSD=0.42%，n=6）. CONCLUSIONS：The method is simple with good reprosucibility and high sensibility，and can be used for the simultaneous determination of paeoniflorin and paeonol in Dirda pill.

Dieda pill；Paeoniflorin；Paeonol；Content determination；HPLC

R917

A

1001-0408（2016）27-3870-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.42

＊主管药师。研究方向：药品检验。电话：0317-2063949-8202。E-mail：43995455@qq.com

（2015-11-13

2016-07-07）