牛羊肉毒梭菌（C型）灭活苗的保存期试验

李元新 刘来利 王必成 冯玲霞 张鹏岳

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000）

牛羊肉毒梭菌（C型）灭活苗的保存期试验

李元新 刘来利 王必成 冯玲霞 张鹏岳

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000）

对研制的牛羊肉毒梭菌（C型）灭活苗二批分别置于0℃-4℃冰箱或室温（15℃）条件下，存放，每年用小白鼠进行效力试验，观察疫苗保存期。结果表明疫苗置于0℃-4℃冰箱或室温（15℃）条件下，3年仍可达灭活苗的效价，保存期暂定为3年。

牛 羊 肉毒梭菌（C型） 灭活苗

肉毒梭菌是一种革兰阳性厌氧芽孢梭菌，其产生的肉毒毒素能引起人畜严重的中毒症状，甚至导致死亡，病死率高达79.53%。目前控制肉毒棱菌中毒症的有效手段就是预防接种疫苗，为此研制出用于预防C型肉毒梭菌中毒症灭活疫苗，为使疫苗在生产中起到良好效果，避免免疫失败，给养殖业造成损失。对保存于不同环境和时间下的疫苗进行效力测定，确定不同环境和时间的疫苗保存期。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 种毒 制造与检验用的菌种为C型肉毒梭菌菌株，系1965年从甘肃省瓜州县黄牛体内分离，经中国兽医药品监察所鉴定为C型肉毒梭菌菌株。

1.1.2 菌种标准 本菌为革兰氏阳性粗大杆菌，产生偏端芽孢，为严格的厌氧菌，在新鲜生肝块的厌气肉肝汤或肉肝胃酶消化汤培养5～7日，培养液毒力不应低于50000MLD/ml（14～16 g的小白鼠静脉注射）。

1.1.3 试验动物 小白鼠，体重16～20g。

1.1.4 生产和检验用培养基 鱼（或）肉胃酶消化肉肝汤、硫乙醇酸盐（TG）、酪胨琼脂（GA）和葡萄糖蛋白胨汤（GP）培养基，普通琼脂斜面、厌气肉肝汤、保蒲氏胰酶消化半固体培养基。

1.1.5 佐剂 氢氧化铝胶，购自甘肃省生物药厂。

1.2 方法

1.2.1 生产用种子制备

（1）一级种子繁殖及鉴定。将菌种接于厌气肉肝汤或肉肝胃酶消化半固体（含0.05%琼脂，0.5%明胶）培养基中，于37℃培养3日后，测毒及涂片镜检，应纯粹并用普通琼脂斜面、厌气肉肝汤及普通肉汤各2管，每管接种0.2mL，培养3～5日，应纯粹，即作为一级种子管，在2℃～8℃保存，使用期不超过15日。

（2）二级种子繁殖。将一级种子1～2株，接种于培养中，置37℃培养3～5日，抽样做纯检，应纯粹，在2℃～8℃保存，应用期应不超过5日。

1.2.2 制苗用菌液制备

（1）用玻璃培养瓶培养。按容量装入80%左右的培养基，用玻璃瓶培养时加入1/10肝块，而按5∶1加入氢氧化铝胶，混合后，118℃灭菌60min，玻璃瓶冷至37℃左右，按培养基总量的1%～2%接入种子，同时加入灭菌的葡萄糖溶液，使其最终含量为0.5%，30℃～35℃静止培养5～7日，培养基如经存放，在接种前应煮沸驱氧，冷至37℃左右立即接种。

（2）毒素测定。每批抽样测定毒素。用体重14～16 g的小白鼠静脉注射，每1mL不应低于50000MLD。采用小白鼠腹腔注射测毒，剂量为0.5ml/只，毒素稀释液采用0.2%明胶磷酸盐缓冲液（pH为6.8）。采用10倍梯度稀释。

（3）灭活脱毒。按菌液量0.8%加入甲醛溶液，并按0.01%加入硫柳汞；在37℃脱毒10日，每日摇瓶2次。

（4）灭活检验。每瓶取样接种普通琼脂斜面、普通肉汤、加新鲜生肝块的厌气肉肝汤，或加0.05%琼脂、0.05%明胶的半固体培养基各1管每管接种菌液0.2ml，在37℃培养5～10日，应无菌生长。

（5）脱毒检验。在无菌检验同时，离心取上清液，静脉注射体重16～20g小白鼠2只，每只0.4ml，观察5日，不应死亡。如有小白鼠死亡，应继续脱毒。

1.2.3 配苗

灭活检验合格后，玻璃培养的滤出肝块，按菌液5份加铝胶1份的比例加入无菌氢氧化铝胶，用8%氢氧化钠调节至pH7.0 ±0.2，充分摇匀。

（1）半成品检验。配苗完成后，取样做无菌检验。做厌氧性、需氧性细菌检验及霉菌及腐生菌检验（葡萄糖蛋白胨汤培养基G.P），灭菌效果检验（保蒲氏胰酶消化液半固体培养基），应无菌生长。

（2）分装。经无菌检验合格后，进行定量分装，分装时应随时搅拌，使其混合均匀。2℃～15℃保冷暗处存。

（3）牛羊肉毒棱菌（C型）灭活苗保存期测定方法。二批苗置于0℃～4℃冰箱或室温（15℃）条件下，存放3y，每年用小白鼠通过血清中和试验进行效力检验，观察3～5d，确定疫苗保存期。

2 结果

表 牛羊肉毒棱菌（C型）灭活苗保存期试验结果

由上表可见，牛羊肉毒棱菌（C型）灭活苗保存于0-4℃冰箱或室温（15℃），分别在保存1y，2y，3y后，用小白鼠进行血清中和试验，结果均合格。因此可以确定牛羊肉毒棱菌（C型）灭活苗保存期为3y，即3y仍可达到疫苗的使用效价。

［1］张振兴.姜平平.实用兽医生物制品技术［M］.北京：中国农业出版社，1996.

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目，项目编号：GNSW-2012-15

李元新（1971-），男，甘肃平凉人，兽医硕士，副研究员，主要从事动物疫病防治与疫苗开发研究工作。