黄芪茎叶药物成分及营养成分测定

2016-11-24 11:19周庆民冯万宇王靓靓宁秀云

中国草食动物科学 2016年5期

关键词：定容皂苷黄酮

张艳，周庆民，徐馨，冯万宇，黄健，王靓靓，宁秀云

（1.黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省大庆市畜牧兽医局，大庆 163000；3.黑龙江省讷河市动物防疫站，齐齐哈尔 161300）

黄芪茎叶药物成分及营养成分测定

张艳1，周庆民1，徐馨1，冯万宇1，黄健1，王靓靓2，宁秀云3

（1.黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省大庆市畜牧兽医局，大庆 163000；3.黑龙江省讷河市动物防疫站，齐齐哈尔 161300）

黄芪药用至今已有2 000多年的历史，具有补气固表、托毒排脓、利尿、生肌的功效。传统黄芪应用只重视其根部的药用价值，其茎叶部分视为废物，十分可惜。为了充分利用黄芪资源，对黄芪茎叶的药物成分及营养成分进行测定。结果显示：黄芪茎叶中含有多量皂苷、多糖、黄酮、营养物质及微量元素，有些成分甚至高于根部。表明黄芪茎叶不但具有药物与营养的双重价值，而且还具有资源丰富、价格低廉、无药物残留等优势，将其作为饲料饲喂动物，可起到预防保健的功效。

黄芪茎叶；有效成分；营养成分；微量元素

黄芪作为我国的传统中药，首次记载于《神农本草经》［1］，活性成分主要有皂苷类［2］、多糖类［3］、黄酮类［4］。黄芪茎叶是黄芪的地上部分，以往黄芪成熟后作为药用的主要是地下根部，而其茎叶含有效成分较少，不能入药，在采挖后被弃掉。为了充分利用黄芪资源，笔者等对黄芪茎叶中的药物成分及营养成分进行测定，以期作为饲料饲喂动物，并预防某些疾病的发生。

1 材料与方法

1.1 药材

黑龙江产黄芪茎叶，晾干，阴凉处保存。

1.2 主要试剂

黄芪甲苷、葡萄糖和芦丁标准品购自中国食品药品检定研究院；其他化学试剂均为分析纯。

1.3 黄芪茎叶中有效成分含量测定

1.3.1 标准溶液的制备取黄芪甲苷标准品2.05 mg，甲醇定容至于10 mL量瓶中，即得黄芪甲苷标准液（含黄芪甲苷 0.205 mg/mL）；取葡萄糖标准品25 mg，蒸馏水定容至50 mL摇匀，即得葡萄糖标准液（含葡萄糖0.500 mg/mL）；精确称取芦丁标准品10.0 mg，95%乙醇定容于25 mL的容量瓶中，即得芦丁标准液（含芦丁0.400 mg/mL）。

1.3.2 黄芪茎叶中总皂苷含量测定［5］

1.3.2.1 总皂苷的提取与鉴定取黄芪茎叶，于60℃低温烘干，粉碎后称取5 g，以20倍量的70%乙醇对其进行回流提取2.5 h，后对乙醇进行浓缩，加入等量水，冰镇后过滤，回收乙醇，水饱和乙酸乙酯萃取3次（20∶15∶10），过滤水层，用水饱和正丁醇萃取3次（20∶15∶10），减压回收正丁醇层，过D101树脂柱，蒸馏水和70%乙醇洗脱，浓缩，水浴蒸干，用甲醇定容得皂苷样品液。采用Liebermann-Burchard（醋酸浓硫酸反应）、Lalkowski反应和三氯醋酸反应对提取物进行鉴定。

1.3.2.2 黄芪茎叶中皂苷含量测定分别吸取标准溶液0.30、0.60、1.20、1.80、2.40 mL于有塞试管内，水浴使溶剂挥发，分别加入0.2mL现配的5%香草醛冰醋酸和0.8 mL高氯酸，60℃水浴15 min，流水冷却2 min，补冰醋酸至5 mL混匀，做空白对照，在552 nm波长处测定吸光度。以吸光度（y）为纵坐标、黄芪甲苷微克数（x）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。精确量取皂苷样品液，按标准曲线操作步骤，计算总皂苷含量。

1.3.3 黄芪茎叶中多糖含量测定［6］

1.3.3.1 多糖的提取与鉴定精确称取黄芪茎叶粉末2.0 g于100 mL锥形瓶中，加入40 mL蒸馏水，调节pH=9.0，超声提取20 min（80℃，1 000 Hz），低温离心15 min（5000 r/min），将药渣与药液分离，重复上述操作，将两次收集的药液混合，洗涤药渣3次，与之前药液混合，布氏漏斗中抽滤，浓缩后用蒸馏水定容至50 mL，即为多糖样品液。采用蒽酮-硫酸法、α-萘酚反应和菲林反应对提取的多糖进行鉴别。

1.3.3.2 黄芪茎叶中多糖含量测定分别量取标准液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，以蒸馏水定容至10 mL，混匀。各取1.0 mL与1.0 mL新配的5.5%苯酚混匀，加入浓硫酸5.0mL，震荡5min，沸水煮15min，立即冰浴15min，设空白对照，在498 nm波长出测定吸光度。以吸光度（y）为纵坐标、溶液浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。精确量取多糖样品液0.1 mL，蒸馏水定容至 10 mL，取1 mL加1 mL蒸馏水混合，按标准曲线步骤操作，计算总多糖含量。

1.3.4 黄芪茎叶中黄酮含量的测定［7］

1.3.4.1 黄酮的提取与鉴定取黄芪茎叶，60℃低温烘干，粉碎后称取5 g，用20倍量70%乙醇回流提取2.5 h，后对乙醇进行浓缩，加入等量水，冰镇后过滤，残渣再重复提取1次，将两次滤液混合，挥干，用甲醇定容。采用HCL-Mg反应、三氯化铝反应和乙酸镁反应对提取的黄酮进行鉴定。

1.3.4.2 黄芪茎叶中黄酮含量的测定分别精确量取芦丁标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL于25 mL容量瓶中，加入1 mL的5%亚硝酸钠摇匀，静置5 min，再加入1 mL的10%亚硝酸铝摇匀，静置5 min，加入4%氢氧化钠10 mL，加水至刻度摇匀，静置15 min，在510 nm波长处测定吸光度。以吸光度（y）为纵坐标、溶液浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。精密称取1 mL样品液，以95%乙醇定容于10 mL容量瓶中，按标准曲线步骤操作，计算黄酮含量。

1.4 黄芪茎叶中常规营养成分测定

1.4.1 黄芪茎叶中干物质含量测定将称量瓶恒重，记质量为W1，加入5 g黄芪茎叶粉末后记质量为W2，将称量瓶放入温箱105℃烘干6 h，冷却30 min称重，重复烘干至恒重，记终质量为W3，依据下式计算干物质含量。

干物质（%）=［（W3-W1）/（W2-W1）］×100%

1.4.2 黄芪茎叶中粗蛋白含量测定采用凯氏定氮法测定。用滤纸包精确称取黄芪茎叶粉末1.0 g放入凯氏管底部，加入6.4 g混合催化剂和98%硫酸12 mL，于消化仪上文火加热，焦化泡沫消失后再加强火，待溶液呈透明的蓝绿色终止加热。冷却后将凯氏管固定在凯氏定氮仪上，将冷凝管末端浸入混合有20 mL硼酸和2滴混合指示剂的锥形瓶中。蒸汽蒸馏，持续滴加40%氢氧化钠直至消化液变为褐色。用0.1 mol/L的HCl滴定，直至滴定终点（蓝绿色变成灰红色），记录使用HCl的体积（吸收液耗用体积记为V1，空白液耗用体积记为V2），依据下式计算蛋白质含量。

蛋白质（%）=［C×（V1－V2）×0.014 01/（m×0.1）］×F×100%（F=6.25，饲料蛋白质含量换算系数）1.4.3黄芪茎叶中粗纤维含量测定采用提滤法测定。精确称取黄芪茎叶粉末，记重W1，脱脂后放入烧杯。加入预热的已知浓度的硫酸200 mL，继续加热使其在2 min内沸腾，加入1～2滴正辛醇除泡沫，持续微沸30 min，进行抽滤，使用沸水冲洗残渣直到变为中性后抽干。残渣中加入预热的氢氧化钠溶液200 mL，继续加热30 min，然后在古氏坩埚上过滤，先用硫酸洗涤，残渣转移到坩埚内用水冲洗至中性，最后用15 mL乙醇洗涤、抽干。将盛有残渣的坩埚130℃烘干2 h，然后干燥器中冷却称重，坩埚和残渣记重W2，再将盛有残渣的坩埚550℃灼烧30 min，干燥冷却30 min，坩埚及残渣记重W3，根据下式计算粗纤维含量。

粗纤维（%）=［（W2-W3）/W1］×100%

1.4.4 黄芪茎叶中粗脂肪含量测定采用索氏浸提法进行测定。滤纸包和称量瓶恒重，记重W1。精确称取黄芪茎叶粉末1 g于滤纸包中，105℃烘干6 h，冷却称量，重复至恒重，记重W2。将滤纸包放入索氏抽提器，30～60℃乙醚抽提50～70次，滤纸包放入称量瓶，挥干乙醚，105℃烘干2 h，冷却称重，重复至恒重，记重W3，根据下式计算粗脂肪含量。

粗脂肪（%）=［（W2-W3）/（W2-W1）］×100%

1.4.5 黄芪茎叶中粗灰分含量测定采用烧灼残渣法测定。将坩埚恒重，记重W1。精确称取黄芪茎叶粉末1 g放入坩埚，记重W2。先250℃炭化，然后550℃灼烧3 h，取出冷却称重，重复至恒重，记重W3，根据下式计算粗灰分含量。

粗灰分（%）=［（W2-W3）/（W2-W1）］×100%

1.4.6 黄芪茎叶中无氮浸出物含量计算采用相差计算法计算。

无氮浸出物（%）=干物质（%）-［粗蛋白质（%）+粗脂肪（%）+粗纤维（%）+粗灰分（%）］

1.5 黄芪茎叶中常量及微量元素含量测定

1.5.1 黄芪茎叶中钙含量测定采用EDTA直接容量法测定。精确称取黄芪茎叶粉末5 g于坩埚中，先250℃炭化，然后550℃灼烧3 h，加入10 mL盐酸和几滴浓硝酸，煮沸后完全倒入100mL容量瓶，冷却后蒸馏水定容，摇匀即为样品分解液。准确量取10 mL样品分解液于250 mL锥形瓶，加入蒸馏水50 mL、三乙醇胺2 mL、乙二胺1 mL、淀粉液10 mL、品绿1滴，使用氢氧化钾滴定至无色，再过量10 mL，加入0.1 g的盐酸羟胺和少许加钙黄绿素。立即在黑色背景下用EDTA标准液滴定，滴定终点为黄绿色荧光转为紫红色，然后计算钙含量。

1.5.2 黄芪茎叶中磷含量测定采用磷钼钒酸比色法测定。按上述方法制备样品分解液，分别准确吸取磷标准液0、1.0、2.0、5.0、10.0和15.0 mL于50 mL容量瓶中，各加10 mL钒钼酸铵显色剂，用水定容摇匀，静置15 min，以0 mL为参照，分光光度计420 nm波长处测定各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标（x）、吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线。精确吸取样品分解液1～10 mL，按标准曲线绘制方法测得样品分解液吸光度，计算黄芪茎叶中磷的含量。

1.5.3 黄芪茎叶中微量元素含量测定采用《动物饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定》（GB/T13885—2003）方法进行测定。

2 结果

2.1 黄芪茎叶中有效成分含量

2.1.1 黄芪茎叶中总皂苷含量样品液Liebemann-Burchard反应见液面由黄色转变为紫红色，Lalkowski反应见三氯甲烷层出现黄绿色荧光，三氯醋酸反应试纸由红色变紫色，表明样品液含有皂苷。依绘制的标准曲线（图1），得回归方程：y=0.00184 x-0.015 64，R2=0.997 75（n=5）。结果表明，黄芪甲苷在61.5～492 μg范围内线性关系良好，黄芪茎叶中总皂苷含量为23.35 mg/g。

2.1.2 黄芪茎叶中多糖含量样品液蒽酮-硫酸反应呈蓝色透明液体，α-萘酚反应液面交界处出现紫红色环，菲林反应阳性，表示样品液成分为多糖。依绘制的标准曲线（图2），得回归方程：y=5.865 8 x-0.021 02，R2=0.997 92（n=6）。结果表明，标准液浓度在0.01～0.10 mg/mL范围内线性关系良好，黄芪茎叶中多糖含量为27.04 mg/g。

2.1.3 黄芪茎叶中黄酮含量样品液HCl-Mg反应溶液变为粉红色，三氯化铝反应日光下呈灰黄斑点、紫外光下呈黄绿荧光斑点，乙酸镁反应紫外光下见黄色斑点，表明样品液含有黄酮类物质。依绘制的标准曲线（图3），得回归方程：y=0.009 59 x+0.329 2，R2=0.997 37（n=6）。结果表明，标准液浓度在8～48 μg/mL范围内线性关系良好，黄芪茎叶中黄酮含量为5.61 mg/g。