亚麻木酚素对复合因素诱导大鼠骨质疏松症的治疗作用研究

李兴勇，魏晓辉，李喜香，刘效栓，陈二林，杨旭涛，吴国泰

（1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730000；2.兰州市第一人民医院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000）

亚麻木酚素对复合因素诱导大鼠骨质疏松症的治疗作用研究

李兴勇1，魏晓辉2，李喜香1，刘效栓1，陈二林1，杨旭涛3，吴国泰3

（1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730000；2.兰州市第一人民医院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000）

目的：观察亚麻木酚素（FLs）对实验性骨质疏松大鼠的治疗作用。方法：60只SD大鼠随机分为正常对照组，模型对照组，阳性对照组和FLs低、中、高剂量组，除正常对照组外其余各组灌胃醋酸泼尼松，第8天灌胃维甲酸。造模第14天，FLs低、中、高剂量组大鼠分别灌胃不同剂量的FLs混悬液，阳性对照组灌胃雌二醇，正常对照组和模型对照组灌胃等容量的蒸馏水，连续14天。结果：造模后，与正常组比较模型组大鼠血清钙和磷的含量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），骨钙含量降低（P＜0.05），Pmax、Mmax明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，FLs高剂量组股骨重量增加（P＜0.05），FLs高、中剂量组大鼠血清钙和磷的含量均明显升高（P＜0.05，P＜0.01），FLs各剂量组骨钙含量明显升高（P＜0.05），FLs各剂量都能不同程度提高Pmax，Lmax，Mmax和骨应变（P＜0.05，P＜0.01）。FLs各剂量组骨小梁数量增加，骨小梁厚度增厚，平均骨小梁间距减少，骨小梁体积百分比增大，平均骨皮质厚度增加（P＜0.05，P＜0.01）。结论：亚麻木酚素对泼尼松和维甲酸所致的大鼠骨质疏松有一定的治疗作用。

亚麻木酚素；骨质疏松大鼠模型；治疗作用

骨质疏松症是以骨量减少及骨组织显微结构破坏为特征的一种全身性骨骼疾病，随着人口老龄化，骨质疏松症发病率不断升高，其研究亦日益受到全球的重视［1-2］。雌激素缺乏是导致绝经后骨质疏松发生的主要原因，故雌激素是目前治疗骨质疏松症的首选药物之一，但其存在增加乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等风险［3］。亚麻木酚素（FLs）与雌激素结构十分相似。亚麻木酚素对雌激素依赖性疾病乳腺癌、前列腺癌、经期综合征、骨质疏松有预防作用，对糖尿病、胃肠肿瘤、冠心病、肾脏病具有辅助治疗作用［4-5］。本研究通过建立实验性大鼠骨质疏松症模型，观察FLs对股骨重量，血清和骨钙、磷的含量，骨生物力学及骨组织形态学指标变化的影响，探讨其对大鼠骨质疏松的治疗作用。

1　材料

1.1 动物

SD大鼠，SPF级，60只，雌性，体质量（200±2）g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK（甘）2011-0001，动物实验设施使用证号SYXK（甘）2011-0001。SPF级饲料（由北京科奥协力饲料有限公司提供）喂养，自由饮水，室温（25±0.5）℃，相对湿度（55±5）%，12h灯光，12h黑暗，适应7天后开始实验。

1.2 药品与试剂

亚麻木酚素由甘肃省中医院药剂科提供（口服拟推荐临床成人日用量0.2g）。醋酸泼尼松由浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号141126。维甲酸由上海源叶生物科技有限公司生产，批号SN1114CA14。戊酸雌二醇由拜耳医药保健有限公司广州分公司生产，批号153A。钙测试盒由南京建成生物工程研究所生产，批号20150326。无机磷测试盒由南京建成生物工程研究所生产。

1.3 主要仪器

Nestorius电子天平由德国Nestorius生产，XYJ-2低温离心机由金坛市恒丰仪器厂生产，AG-107A型自动控制电子万能试验机由日本岛津生产，P型陶瓷纤维马弗炉由北京美诚科学仪器有限公司生产，3300型紫外分光光度计由上海美谱达仪器有限公司生产，AG-107A型自动控制电子万能试验机由日本岛津生产，BX60-32FB3-F01型OLMPUS显微镜由奥林帕斯公司生产，大恒细胞分析系统由中国大恒集团有限公司生产，TEC5组织包埋机由北京怡康勇佳科技有限责任公司生产，TEKVIP5全自动密闭式组织脱水机由北京怡康勇佳科技有限责任公司生产，RM2135石蜡切片机由德国Leica公司生产。

2　方　法

2.1 造模、分组及给药

60只大鼠随机分为6组，设正常对照组、模型对照组、阳性对照组、亚麻木酚素（FLs）低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只。除正常对照组外其余各组灌胃醋酸泼尼松20mg/kg、每天1次、连续7天，第8天灌胃维甲酸80mg/kg、每天1次、连续8天。造模第14天，FLs低、中、高剂量组大鼠灌胃亚麻木酚素（分别为0.05g/kg、0.1g/kg、0.2g/kg，相当于临床成人日用量的7、14、28倍），阳性对照组灌胃雌二醇（1.5mg/kg，相当于临床成人日用量的14倍），正常对照组和模型对照组灌胃等容量的蒸馏水，连续14天。

2.2 指标与检测方法

体质量和股骨重量。各组大鼠每3天称体质量1次，观察大鼠的运动情况，皮毛光泽、饮食情况等，末次给药60min后，取血后处死大鼠，摘取左侧股骨，剔除肌肉肌腱等组织，称股骨重量。

血清钙和磷含量。末次给药60min后，麻醉大鼠，股动脉取血，分离血清（低温离心，3500r/min，10min）用比色法在660nm波长处测定钙、磷含量。磷含量（mmol/L）=（测定OD值-空白OD值/标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（0.5mmol/L）×样本前处理稀释倍数（5倍）。钙含量（mmol/L）=（测定OD值-空白OD值/标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（2.5mmol/L）×样本前处理稀释倍数（5倍）。

骨钙和磷含量。分离大鼠左侧股骨，剥净软组织，放入干燥箱中，90℃烘干2h后用天平称干重（精确至0.1mg）。在电炉上炭化后置马福炉中，800℃灰化2h，冷却至室温，称重。称取0.10g骨灰，加3%硝酸溶液3mL，室温放置48h，待溶液呈无色透明，用试剂盒测定溶液中钙和磷的含量。

骨生物力学指标测定。取右股骨进行骨生物力学试验，计算最大载荷（Pmax）、最大扰度（Lmax）、最大弯矩（Mmax）、骨应力（σ）和骨应变。

骨组织形态计量学参数。取右侧股骨，10%甲醛常规固定，脱钙，切片，H-E染色，应用病理图像分析仪于100倍下，在干骺端生长板下约2mm近皮质处取视野为测量范围，计算骨小梁数量（TN）、平均骨小梁厚度（TMPT）、平均骨小梁间距（TMPS）、骨小梁体积百分比（TBV）及平均骨皮质厚度（MCBT）。

3　结　果

FLs对大鼠体质量和股骨重量的影响见表1。

表1 FLs对大鼠体质量和股骨重量的影响 （g，±s）

表1 FLs对大鼠体质量和股骨重量的影响 （g，±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05。

组别　n剂量（mg/kg）　　体质量　　股骨重量正常对照组　10　　—　234.62±15.92　0.31±0.08模型对照组　10　　—　206.97±17.96**0.27±0.06*阳性对照组　10　1.5　193.11±9.38　0.29±0.05 FLs高剂量组　10　200　209.24±14.05　0.31±0.09△FLs中剂量组　10　100　219.93±14.04　0.24±0.05 FLs低剂量组　10　50　202.10±14.15　0.29±0.06

FLs对大鼠血清钙和磷含量的影响见表2。

表2 FLs对大鼠血清磷和钙含量的影响 （mmol/L，±s）

表2 FLs对大鼠血清磷和钙含量的影响 （mmol/L，±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别　n剂量（mg/kg）　Ca含量　P含量正常对照组　10　　—　2.47±0.71　1.00±0.25模型对照组　10　　—　2.03±0.43*　1.48±0.18**阳性对照组　10　1.5　2.63±0.42△　1.10±0.39△FLs高剂量组　10　200　2.59±0.35△　1.18±0.38△FLs中剂量组　10　100　2.94±0.44△△　1.25±0.18△FLs低剂量组　10　50　2.30±0.45　1.35±0.43

FLs对大鼠股骨中钙、磷含量的影响见表3。

表3 FLs对实验性骨质疏松大鼠股骨中钙、磷含量的影响 （±s）

表3 FLs对实验性骨质疏松大鼠股骨中钙、磷含量的影响 （±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05。

组别　n剂量（mg/kg） 钙含量（mg/g） 磷含量（mg/g）正常对照组 10　　—　224.54±32.33　204.73±1.36模型对照组 10　　—　156.13±27.67*　205.21±0.00阳性对照组 10　1.5　108.79±41.16　205.21±0.00 FLs高剂量组 10　200　186.45±30.40△　203.38±0.00 FLs中剂量组 10　100　203.04±136.47△　204.98±0.03 FLs低剂量组 10　50　196.65±168.52△　204.98±0.03

FLs对大鼠骨生物力学指标的影响见表4。

表4 FLs对大鼠骨力学指标的影响 （±s）

表4 FLs对大鼠骨力学指标的影响 （±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别　n　　剂量（mg/kg）　Pmax（n）　Lmax（mm）　Mmax（M）　　σ（N/mm2）　　骨应变（%）正常对照组　10　　—　103.41±7.28　0.98±0.24　465.6±40.5　99.41±12.65　4.52±1.35模型对照组　10　　—　86.46±6.85＊＊　0.85±0.35　380.4±36.4＊＊　82.25±11.60＊　4.04±1.20阳性对照组　10　1.5　97.52±7.64△　1.06±0.38#　435.2±41.8△△　101.56±16.54△△　4.68±0.92△FLs高剂量组　10　200　96.83±6.89△　1.23±0.13#　455.3±50.2△△　98.61±12.94△△　4.66±0.87△FLs中剂量组　10　100　93.56±10.56　0.95±0.34　438.0±52.6△　90.50±8.46△　4.32±0.66 FLs低剂量组　10　50　91.94±8.34　0.90±0.19　405.6±59.5　86.25±18.40　4.30±1.28

FLs对大鼠骨组织形态计量学指标的影响见表5。

表5 FLs对实验性骨质疏松大鼠骨组织形态计量学指标的影响 （±s）

表5 FLs对实验性骨质疏松大鼠骨组织形态计量学指标的影响 （±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别　n　　剂量（mg/kg）　TN（n）　MTPT（μm）　MTPS（μm）　MBCT（μm）　TVB（%）正常对照组　10　　—　3.26±0.35　7.56±0.54　8.16±0.85　10.65±0.88　40.50±1.42模型对照组　10　　—　2.05±0.92＊＊　6.06±0.37＊　12.04±1.40＊＊　8.66±0.64＊＊　25.89±1.95＊＊阳性对照组　10　1.5　2.68±0.62△　7.22±0.58△△　10.25±1.11△　11.51±0.77△△　34.00±1.33△△FLs高剂量组　10　200　2.80±0.39△　7.68±0.38△△　9.32±1.20△△　9.88±0.82△　38.14±1.80△△FLs中剂量组　10　100　2.60±0.64△　6.91±0.30#　10.10±0.96#　9.57±0.83△　36.07±2.18△△FLs低剂量组　10　50　2.14±0.91　6.18±0.33　10.61±0.88　8.85±0.69　38.33±2.74△△

4　讨　论

维甲酸也叫维A酸，是维生素A的衍生物，可影响骨的生长、发育和代谢，维甲酸既可增加成骨细胞的数量，又刺激破骨细胞使其活性增强，从而使骨代谢呈现高转换型改变，但总趋势是骨吸收大于骨形成，是骨质疏松症动物模型制备的常规试剂，病理模型符合继发性骨质疏松症的临床特点，稳定性较高，重复性较好［6-8］。泼尼松为临床常用糖皮质激素类药物，糖皮质激素能分别促进和抑制破骨细胞和成骨细胞的功能，可抑制骨组织中蛋白质、胶原合成、细胞生长及RNA合成、导致骨质疏松［9-10］。用两种造模剂建立大鼠实验性骨质疏松症模型，模型大鼠体质量和股骨重量明显降低，血清钙和磷的含量均显著降低，骨钙含量降低，Pmax，Mmax，TN、MTPT、MTPS、TBV和MCBT均明显减小，骨小梁稀疏、断裂，骨髓腔扩大，说明大鼠骨质疏松模型复制成功。

骨质疏松症可引起单位体积内骨量减少，骨皮质变薄，髓腔增宽，骨负载功能减弱，从而引起脊柱畸形甚至骨折，目前认为钙的缺乏，激素水平，细胞因子，营养状况，生活习惯，遗传基因，药物和疾病，运动和制动等因素与骨质疏松症的发生有关［11］。中老年人易得骨质疏松症，是由于随年纪的增大，体内血钙被酸性物质所中和，导致血钙含量下降，引起体内钙失衡。绝经后骨质疏松症在老年女性中高达82.30%，其原因是卵巢活性下降，合成激素效率降低，导致钙的流失。所以，雌激素替代疗法效果较为明显，而亚麻木酚素属于植物雌激素样物质，具备雌激素的结构，临床研究发现，经过亚麻木酚素治疗的患者在治疗后体内BMD和血清钙明显升高，增强甲状腺旁腺激素的敏感性，重新催生新的骨基质，同时还能起到抑制骨吸收，降低其转换率［12-15］。研究显示，亚麻木酚素能增加模型大鼠股骨重量，升高血清钙和磷的含量，增加骨钙含量，也能不同程度提高Pmax，Lmax，Mmax和骨应变，骨组织形态学显示骨小梁数量增加，骨小梁厚度增厚，平均骨小梁间距减少，骨小梁体积百分比增大，平均骨皮质厚度增加。亚麻木酚素对实验性骨质疏松具有一定的治疗作用，但其作用机制还有待进一步研究。

［1］ 蒋建发，孙爱军.中老年女性骨质疏松症流行病学现状、分类及诊断［J］.中国实用妇科与产科杂志，2014，30（5）：323-326.

［2］ 王君鳌，林定坤.骨质疏松症的研究和进展［J］.中国骨质疏松杂志，2001，7（4）：372-374.

［3］ 杨如会，沈祥春，任光友，等.骨质疏松症治疗药物研究进展［J］.中国骨质疏松杂志，2007，13（6）：436-439.

［4］ 沈晓东，李多伟，赵蓉.亚麻木酚素的研究进展［J］.中成药，2009，（4）：598-600.

［5］ 张进丽.亚麻木酚素（SDG）治疗中老年女性骨质疏松症的临床研究［J］.中国现代医学杂志，2013，23（31）：64-66.

［6］ 张月峰，韩景献.骨质疏松动物模型研究进展［J］.动物医学进展，2005，26（3）：8-11.

［7］ 朱虎虎，孙炜，孙建新，等.维甲酸诱导雌性大鼠骨质疏松模型建立的效果观察［J］.当代医学，2013，19（3）：24-26.

［8］ 吴波，徐冰，黄添友，等.维A酸致大鼠骨质疏松模型与机理研究［J］.药学学报，1996，31（4）：241-245.

［9］ RAISA LG .Mechanisms and regulation of bone reserption by osteoclastis cells.In：Coe FL，Favus MJ eds.Disorders of bone and mineral metabohim［M］. New York：Connecticut Raven Press，Ltd，1992：287-290.

［10］ LUKERT BP，RAISZ LG. Glucocorticoidinduced osteoporsis pathoaenesis and management［J］.Aun Iwtern Med，1990，112（2）：352-355

［11］ 黄志勇，谭志明，庄宇.骨质疏松症的影响因素的临床分析［J］.中国现代药物应用，2010，4（16）：85-87.

［12］ 陈见南.国外亚麻子保健作用综合研究和应用近况［J］.中国医药情报，2001，7（3）：54-56.

［13］ 胡晓军.亚麻木酚素的营养保健作用［J］.中国食物与营养，2005，11（8）：36-37.

［14］ 杨成涛，赵云令，孙云，等.植物多酚抗骨质疏松作用的研究［J］.2014，35（17）：386-389.

［15］ 谈志龙，任海龙，白人骁，等.骨质疏松症与骨代谢生化测定指标［J］.中国骨质疏松杂志，2006，12（1）：89-93.

Objective：To observe the therapeutic effect of FLs on . Method: 60 SD rats were divided into the control group， the model control group， the positive control group， low dose FLs group， middle dose FLs group and high dose FLs group in random. Each group were given prednisone acetate by gavage and were given retinoic acid by gavage on the 8th day except the normal control group. On the 14th day， the rats in low dose FLs group， middle dose FLs group and high dose FLs group were given different dose FLs suspension by gavage. The positive control group were given E2 by gavage. The normal control group and the model control group were given an equivalent amount of normal saline. It last 14 days continuously. Result: After the model was built， compared with that of the normal group， the content of calcium and phosphorus in serum of the model group decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01），the content of calcium in bone of the model group decreased （P＜0.05)， Pmax and Mmax decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01）. Compared with that of the model group， the femur weight of high dose FLs group increased（P＜0.05），the content of calcium and phosphorus in serum of the high dose FLs group and middle dose FLs group decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01）， the content of calcium in bone of each dose FLs group increased significantly（P＜0.05）， Pmax，Lmax，Mmax and stress and strain of bones increased in different degree（P＜0.05，P＜0.01）.The quantity of bone trabecula increased， the thickness of of bone trabecula increased， the mean trabecular bone spacing(mtbs) decreased，the volume fraction of bone trabecula increased and average cortical bone thickness increased（P＜0.05，P＜0.01）. Conclusion: FLs has certain therapeutic effect on osteoporosis rats due to prednisone acetate and retinoic acid.

FLs；Osteoporosis rat model；Therapeutic effect

R271.917.5

B

1004-2814（2016）10-0948-03

兰州市科技支撑项目（2012-2-77）

李喜香

2016-05-19