青藏高原阿旺绵羊线粒体基因组研究

王富强，杨孝朴

（1.甘肃农业大学动物医学院，兰州730070；2.中农威特生物科技股份有限公司，兰州730046）

青藏高原阿旺绵羊线粒体基因组研究

王富强1，2，杨孝朴1

（1.甘肃农业大学动物医学院，兰州730070；2.中农威特生物科技股份有限公司，兰州730046）

利用重测序方法对青藏高原阿旺绵羊线粒体基因组进行测序、组装，并对基因特点和系统发育进行分析。结果表明：阿旺绵羊线粒体基因组全长16 618 bp，该基因由13个蛋白编码基因、22个转运RNA基因、2个核糖体RNA基因和1个非编码控制区组成；基因特点显示碱基A含量33.69%、T含量27.40%、C含量25.82%、G含量13.09%，A+T含量（61.09%）比G+C含量（38.91%）高，表现出一定的碱基偏好，转换多于颠换，表现较高的转换偏向；基于线粒体基因组构建了31个不同物种的NJ树，表明阿旺绵羊与绵羊属亲缘关系最近，与牛属和岩羊属亲缘关系最远。

阿旺绵羊；基因组；线粒体；系统进化

阿旺绵羊是在青藏高原恶劣气候和特殊生境条件下，经过长期自然选择、闭锁繁育，特别是近十多年的定向系统选育而形成的高原独特绵羊品种类群。主要分布于青藏高原东南部的唐古拉横断山脉北段（即西藏自治区昌都地区贡觉县境内及周边地区），目前存栏总数15.08万只［1］。

高等动物线粒体是共价闭合的环状双链DNA分子，具有较高的突变率和母系遗传特征，特别适合种内、种间及种以上分类阶元的进化研究［2］。巩元芳等［3］用mtDNA基因研究了几个地方绵羊品种线粒体多态性，表明我国地方绵羊品种的起源可能是单一的。管松等［4］研究了中国西南地区5个地方绵羊群体mtDNA遗传多样性，得出西藏绵羊有3个母系来源，云南绵羊有2个母系来源。因此，mtDNA基因可以作为一种遗传标记，用来研究绵羊的起源进化以及亲缘关系。本研究以阿旺绵羊为素材，测定了其线粒体基因序列，并进行对比分析，以期为阿旺绵羊品种的起源分化及遗传亲缘关系研究提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

阿旺绵羊血液采自西藏藏族自治区昌都地区贡觉县阿旺镇阿依第三村（N：30°12′101″、E：98°63′98″），所采血样为6 mL，ACD抗凝，-20℃冻存。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取基因组总DNA的提取按照天根生物有限公司动物组织DNA提取试剂盒说明书操作。

1.2.2引物设计与线粒体DNA基因片段的扩增用DNAMAN进行比对，查出保守序列，利用primer 5设计引物，根据目的基因、pGM-T载体的特点，设计两端含有限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点的引物。

PCR扩增反应体系：阿旺绵羊DNA样品1 μL（75 ng/μL），10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L的dNTP 2 μL， 25 mmol/L MgCl21 μL，正向引物和反向引物（10 μmol/L）各为1 μL，TaqDNA聚合酶0.3 μL（5 U/μL），加灭菌双蒸水至25 μL。未加DNA样品为阴性对照。反应程序：94℃，2 min预变性；94℃、60 s，44℃、60 s，72℃、90 s，35个循环；最后72℃延伸5 min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效率。

1.2.3纯化与测序用北京百泰克生物技术有限公司回收试剂盒进行纯化与回收，将mtDNA的PCR纯化产物与pGM-T连接并转化感受态DH5a，进行蓝白斑鉴定，筛选阳性克隆，并命名为PGM-T-mtDNA。对阳性克隆进行PCR和EcoR I酶切鉴定，对鉴定正确的质粒送由上海生工进行测序。

1.2.4序列分析和系统发育树的构建运用ClustalX软件将测得序列进行比对，辅以人工校正。利用MEGA5.1软件对阿旺绵羊mtDNA基因序列进行种内和种间差异评估［5-6］，用邻接（Neighbour-Joining，NJ）法构建系统发育树，系统发育树各分支的置信度由1 000次自举法（Bootstrap）检验。

2　结果与分析

2.1mtDNA的组成及其变异特点

阿旺绵羊线粒体基因组的组成和注释详见表1和图1所示。阿旺绵羊线粒体基因组全长16 618 bp，该基因由13个蛋白编码基因、22个转运RNA基因、2个核糖体RNA基因和1个非编码控制区组成；基因特点显示碱基A含量33.69%、T含量27.40%、C含量25.82%、G含量13.09%，阿旺绵羊线粒体基因组的组成和其他哺乳动物的组成是相似的［7-8］。A+T含量（61.09%）比G+C含量（38.91%）高，表现出一定的碱基偏好，转换多于颠换，表现较高的转换偏向。13个蛋白编码基因全长11 402 bp，占整个线粒体基因组全长的68.61%；阿旺绵羊与大多数哺乳动物一样，线粒体基因组的编码除了ND6和8个转运RNA基因是从轻链开始编码之外，其余都是从重链开始编码的；13个蛋白编码基因的起始密码子除了ND2、ND3和ND5是ATA之外，其余的起始密码子都是ATG； 5个蛋白编码基因（ND1，ND2，COX3，ND3，ND4）的终止密码子是一个不完整的终止密码子T（aa），然而细胞色素b基因（Cytb）的终止密码子由AGA变为TAA，其余7个蛋白编码基因的终止密码子是典型的TAA。线粒体基因组控制区（D-Loop）位于tRNA-Phe和tRNA-Pro之间，全长1 181 bp（从15 438 bp到16 618 bp），12S rRNA基因的全长959 bp（从69 bp到1 027 bp），16S rRNA基因的全长1 575 bp（从1 095 bp到2 669 bp）；22 tRNA基因的长度在60 bp到75 bp之间变化。

表1　阿旺绵羊线粒体基因组注释

续表1

图1　阿旺绵羊线粒体基因组注释

2.2阿旺绵羊系统发育树的构建

利用本实验测定的阿旺绵羊线粒体基因组序列以及从GenBank数据库下载的30个不同物种的线粒体基因组序列（登录号见图2），通过MEGA 5.1软件基于Kimura两参数距离采用邻位相接法（NJ）（见图2），构建31个不同品种的系统发育树。结果表明，阿旺绵羊与绵羊属亲缘关系最近，与牛属和岩羊属亲缘关系最远，与其他的研究结果是一致的［9-11］。

图2　基于线粒体基因组序列构建的31个不同物种的NJ树

3　结论

本研究对阿旺绵羊线粒体基因组进行克隆测序，对其基因组成和序列变异特点进行注释和分析，初步构建了31个不同物种的系统进化树，研究结果表明，阿旺绵羊属于一个独立的地方绵羊品种，为了解绵羊线粒体基因组的遗传特点和绵羊品种的起源、分化及亲缘关系提供了理论依据。

［1］ 陈天宝，熊朝瑞，骆佳锐，等.阿旺绵羊种质特性研究［J］.中国草食动物，2011，31（1）：68-70.

［2］ Meyer A，Kocher TD，Basasibwaki P，et al，Monophyletic origin ofLake Victoria cichild fishes suggested by mitochondrial DNA sequences［J］. Nature，1990，347：550-553.

［3］巩元芳，李祥龙，刘铮铸，等.几个地方绵羊品种线粒体DNA（mtDNA）细胞色素b基因多态性研究［J］.中国兽医学报，2006，26（2）：213-215.

［4］ 管松，何晓红，浦亚斌.中国西南地区5个地方绵羊群体mtDNA遗传多样性及系统进化研究［J］.畜牧兽医学报，2007，38（3）：219-224.

［5］ Thompson J D，Higgins D G，Gibson T J.ClustalW：improving the sensitivityofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice［J］. Nucleic Acids Res，1994，22：4673-4680.

［6］ Tamura K，DudleyJ，Nei M，et al.MEGA5.1:Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24:1596-1599.

［7］ Zhao E，Yu Q，Zhang N，et al.Mitochondrial DNA diversity and the origin of Chinese indigenous sheep［J］.Tropical Animal Health and Production，2013，45:1715-1722.

［8］HahnC，BachmannL，ChevreuxB.Reconstuctingmitochondrialgenomes directly from genomic next-generation sequencing reads-a baiting and iterativemappingapproach［J］.NucleicAcidsResearch，2013，41:e129.

［9］Hu X D，Gao L Z.The complete mitochondrial genome of domestic sheep，Ovis aries［J］.Mitochondrial DNA，2014：1-3.

［10］LancioniH，DiLorenzoP，Ceccobelli S，et al.Phylogenetic relationships of three Italian Merino-Derived Sheep breeds evaluated through a complete mitogenome analysis［J］.PLoSOne，2013，8（9）:e73712.

［11］ZhongT，Han J L，Guo J，et al.Genetic diversity of Chinese indigenous sheep breeds inferred from microsatellite markers［J］.Small Ruminant Research，2010，90：88-94.

Study and Analysis on Complete Mitochondrial Genome Sequence of Awang Sheep of the Qinghai-Tibetan Plateau

WangFuqiang1，2，YangXiaopu1
（1.College ofVeterinaryMedicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.China Agricultural Veterinarian BiologyScience and TechnologyCo.Ltd，Lanzhou 730046，China）

Awangsheep is a very important local breed of the Qinghai-Tibetan plateau in China.In this experiment，the complete mitochondrial genome sequence of Awang Tibetan sheep were studied for the first time，the results showed that the total length of the mitogenome was 16 618 bp，consisting of 13 protein-coding genes，22 transfer RNA（tRNA）genes，two ribosomal RNA（rRNA）genes，and a non-coding control region（D-loop region）.As in other mammals，its most mitochondrial genes were encoded on the heavystrand.Its overall base composition was A：33.69%，T：27.40%，C：25.82%，and G：13.09%，A+T（61.09%）was higher than G+C（38.91%）.The phylogenetic relationship indicated that the Awang sheep was close with the Ovis aries.

Awangsheep；genome；mitochondrion；phylogenetic

S826.2

A

2095-3887（2016）01-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.001

2015-10-20

王富强（1981－），男，实验师，硕士。

杨孝朴（1962－），男，教授，硕士生导师，主要从事生物化学和分子生物学的教学及研究工作。