外源性褪黑激素对非繁殖季节和田羊睾丸曲细精管组织结构的影响

伊卜拉伊木·胡达拜尔迪，郭金亮，孙贝贝，李 伟，石长青

（塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

外源性褪黑激素对非繁殖季节和田羊睾丸曲细精管组织结构的影响

伊卜拉伊木·胡达拜尔迪，郭金亮，孙贝贝，李 伟，石长青

（塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

为研究外源性褪黑激素（MT）对非繁殖季节和田羊睾丸组织结构的影响，选取体重无明显差异且年龄2岁的健康和田公羊8只，随机分为试验组和对照组，每组4只。在非繁殖季节对试验组每只羊的耳根下方皮下埋植20 mg的MT颗粒，对照组不做埋植处理。两组同舍饲养26 d后，屠宰取出睾丸，用Bouin氏液固定、石蜡切片、H.E染色、光学显微镜观察。结果表明：试验组和田羊睾丸曲细精管的管壁厚度、直径和细胞层数均明显增加，与对照组间均差异极显著（P＜0.01），同时曲细精管内各类生精细胞的数量明显高于对照组。表明外源性MT对非繁殖季节和田公羊的曲细精管中生精细胞发育有促进作用。

褪黑激素；非繁殖季节；和田公羊；睾丸；曲细精管

和田羊是主要分布于新疆和田地区的短尾脂粗毛羊种，具有抗病力强、耐粗饲的特点。其羊毛长而均匀，弹性、光泽和洁白度好，是和田地毯织造的优良原料，2006年被农业部再次列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》［1］。但和田羊属于短日照哺乳动物，其性器官的发育、衰退与生殖机能活动均存在明显的季节性变化规律，仅在秋冬之际开始性腺活动。而在非繁殖季节，性腺发育停止，终止繁殖活动［2］，因此造成其繁殖率不高。大量的研究发现，动物季节性繁殖活动主要是通过光照周期调节松果腺对MT（褪黑激素）的合成与分泌的节律而实现［3］。MT对短日照动物普遍都有提前其发情期的作用［4］，可通过补充外源性MT来使非繁殖季节的公羊处于精子发生的活性状态，以此来调节动物繁殖的季节性［5］。目前，关于通过补充外源性MT对短日照动物如水貂［6］、山羊［7］和獭兔［8］等动物皮毛产量和品质影响的研究较多，而对和田羊睾丸发育及其组织学结构影响的研究较少。本试验对非繁殖季节的雄性和田羊皮下埋植MT，通过对其睾丸曲细精管组织结构的观察，分析外源性MT对和田公羊睾丸的影响，为和田羊的高效繁殖研究工作提供一定的参考依据。

1　材料与方法

1.1试剂与设备

褪黑激素埋植颗粒（MT，含量10 mg/颗粒），埋植器，Bouin氏固定液，梯度酒精（50%、75%、85%、95%、100%），切片石蜡，1%盐酸酒精，二甲苯，中性树胶，伊红染液与苏木精染液。YD-6D生物组织包埋机，DK-S24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），CX31光学显微镜（日本奥林巴斯株式会社），DHG-P246A电热恒温干燥箱（上海博迅实业有限公司），DFC4500C莱卡显微数码照像系统（德国莱卡公司）。

1.2方法

1.2.1样品采集于2015年6月1日，在塔里木大学实验站选取体重无明显差异且年龄2岁的健康和田公羊8只，随机分为对照组和试验组，并编号（每组各4只），然后在试验组每只羊的耳根下方处皮下埋植20 mg的MT颗粒，对照组不做埋植处理。两组羊同舍饲养26 d后，屠宰取出睾丸并切块放入Bouin氏固定液中固定24 h。

1.2.2石蜡切片制备及H.E染色取出固定好的睾丸组织块并修成5 mm×5 mm×2 mm大小，再将组织块放入50%酒精12 h，然后经过梯度酒精脱水（其中75%酒精12 h，85%、95%、100%酒精各1.5 h）。将脱水后的组织块在酒精-二甲苯液中（1:1）过渡15 min。取出经二甲苯透明、浸蜡、自动包埋机石蜡包埋。石蜡切片以5 μm的厚度连续切片，每间隔10张取1张切片铺于45℃恒温水浴锅中展片，用涂有蛋白甘油的载玻片进行捞片并放置在切片架中，在50℃恒温干燥箱中烤片。再经二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各10 min）透明，用梯度酒精（100%、95%、85%、75%）复水（各4 min），然后将水洗后的切片浸入蒸馏水2 min，苏木精染色10 min，1%盐酸酒精分化20 s，流水蓝化，伊红染色2 min，水洗后按50%、75%、80%、95%、100%梯度酒精顺序脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明后用中性树胶封片，自然风干。

1.2.3数据测量及采集在光学显微镜（40倍物镜）下观察睾丸曲细精管的管壁厚度、直径和管壁细胞层数。取每个公羊的睾丸组织切片10张，每张切片取10个曲细精管的正圆形切面，然后在400倍高倍镜下，采用DFC4500C莱卡显微数码照像系统，以“十字”法测量曲细精管横断面的直径、管壁厚度及管壁细胞层数，计算平均值。

1.2.4数据统计分析采用SPSS Statistics 17.0统计软件，对采集到的数据进行One-wayAnova分析。统计结果以平均值±标准差（x±S）表示，以P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著。

2　结果与分析

如图1所示，在非繁殖季节，和田羊睾丸实质部分有大量的曲细精管分布，彼此之间界限明显，曲细精管之间有结缔组织为主要成分所构成的睾丸间质，其间有较多的睾丸间质细胞出现，核圆形、染色深。与对照组相比，试验组睾丸间质组织比例较低，间质细胞大多成群分布；其次试验组曲细精管管壁细胞排列紧密，壁厚且层数较多，处于不同发育时期的生精细胞层次清晰，并出现大量初级精母细胞，胞体大、核大而染色深，同时管腔中出现较多的精子。

图1　和田羊睾丸曲细精管组织结构观察（H.E染色，200×）

对于对照组而言，其睾丸间质组织比例相对高，间质细胞大多散在，曲细精管壁薄，管壁细胞数量少，层数少且排列相对疏松，大多为精原细胞，同时有少量的初级精母细胞，而精子数量较少。

从表1可以看出，皮下埋植MT的试验组公羊睾丸内曲细精管管壁厚度、管径和细胞层数分别为286.00 μm ±20.72 μm、778.99 μm±58.13 μm和4.79层±0.22层，且均极显著高于对照组的 218.82 μm±34.12 μm、616.81 μm±86.55 μm和3.16层±0.32层（P＜0.01）。

表1　试验组与对照组和田羊睾丸曲细精管组织结构比较

3　讨论

褪黑激素是由松果体合成并分泌的一种多功能神经类激素，其通过下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）［10］，在下丘脑水平上调节促性腺激素的合成与分泌，进而影响生殖系统功能，同时也能与垂体、睾丸、卵巢及肾上腺细胞的β肾上腺受体结合，直接调节促黄体生成素、泌乳素、P4和促卵泡刺激素等性腺激素的合成和分泌［11］。大量的研究发现，光照时间的长短可以影响MT的合成和分泌，而在雄性动物的睾丸中，有高亲和力的Mel-1a型的褪黑激素受体，MT能通过与相应受体的结合影响睾丸的生理学形态和生殖功能。对于绵羊和山羊、赤鹿及蓝狐等短日照季节性发情动物，补充外源性MT对其生殖系统的发育有促进作用［12-13］。雄性动物的繁殖性能与睾丸的发育有密切的关系，通过对睾丸组织学水平的研究可较为全面地反映其结构与功能的变化规律［9］。本试验结果表明，对非繁殖季节的和田公羊皮下埋植外源性MT后，睾丸曲细精管管壁增厚、细胞层数增加，并出现精子等情况，表明通过补充非繁殖季节时期机体内相对匮乏的褪黑激素，可使公羊在生理上提前从繁殖静默状态进入繁殖活跃状态，这与姚丽娟等［4］报道的MT能使成年绵羊繁殖季节提前到来的结果吻合，同时也与张培玉等［14］研究的外源性MT可以明显促进水貂睾丸发育及精子产生的报道相同。究其原因，这与补充外源性MT使动物体内MT数量增加后，分布在睾丸组织中的MT受体与充足的MT结合［15］，直接调节垂体合成与分泌促性腺激素，继而促进曲细精管生精细胞发育与分化有关。

从试验结果可以发现，在非繁殖季节，对照组睾丸曲细精管中也出现少量的精子，这个结果说明，羊作为已被长期驯化的短日照繁殖动物，繁殖行为受外部人工环境的影响较大。舍饲条件下，和田羊的繁殖生理变化除了受MT的合成与分泌影响外，还与营养水平和温度条件有关，其协同影响机制还有待于进一步研究。但从对照组与试验组在曲细精管的管壁厚度、管径和细胞层数上差异极显著的结果来看，在非繁殖季节通过埋植外源性MT对激发和田羊提前进入繁殖状态有着非常明显的效果。

4　结论

在非繁殖季节，皮下埋置MT可以促进和田羊睾丸曲细精管生精细胞的发育与分化，其管壁厚度、管腔直径和细胞层数均显著增大。

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Effects of Exogenous Melatonin on the Histological Structure of Seminiferous Tubule of Hetian Rams in Non-breeding Season

Yibulayimu·Hudabaierdi，GuoJinliang，Shi Changqing，et al
（Institute ofAnimal Science，TarumUnniversity，Alar 843300，Xinjiang，China）

In order toinvestigate the effects ofexogenous melatonin on histological structure of seminiferous tubule of Hetian rams in non-breedingseason，eight healthyHetian rams at the age oftwo-year old with similar bodyweight were allotted randomlyinto control group and experimental group，with 4 Hetian rams in each group.The rams in experimental group were implanted ofmelatonin capsules（20 mg）at the subcutaneous ofears，while the rams in control group were not implanted melatonin.After 26 days，the rams testis from two groups were removed and then fixed with Bouin's solution，embedded with paraffin，were cut 5 μm thick sections and stained with H.E，observed with optical microscopy.The results showed that the wall thickness，diameter and cell layers of seminiferous tubule in experimental group increased obviously over the control group（P＜0.01）.Results indicated that exogenous melatonin could promote the development ofspermatogenic cell ofHetian rams in non-breedingseason.

melatonin；non-breedingseason；Hetian ram；testis；seminiferous tubule

S852.2

A

2095-3887（2016）01-0019-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.006

2015-12-26

兵团农业科技攻关项目（2014BA010）；国家大学生创新训练项目（201410757024）

伊卜拉伊木·胡达拜尔迪（1993-），男，本科。

石长青（1971-），男，硕士生导师，主要从事动物生殖内分泌方面的研究。