蛙血清小分子肽的分离鉴定及生物活性检测

陈博 谢琳

1.广东医科大学东莞校区生理科学实验室，广东东莞523808；

2.广东医科大学东莞校区基础医学院，广东东莞523808

蛙血清小分子肽的分离鉴定及生物活性检测

陈博1谢琳2▲

1.广东医科大学东莞校区生理科学实验室，广东东莞523808；

2.广东医科大学东莞校区基础医学院，广东东莞523808

目的分离和鉴定蛙血清去蛋白提取物中的小分子肽，检测其生物活性。方法用超滤法收集蛙血清中相对分子质量为1000～3000的组分；用RP-HPLC对超滤组分进行分离纯化；用串联质谱法分析鉴定小分子肽的分子质量；用呼吸检压仪测定并计算肝细胞呼吸活性和刺激指数。结果将相对分子质量为1638的小分子肽的二级质谱数据经处理后在数据库搜索，没有搜索到相关肽的信息，可能是新发现的肽。呼吸活性检测显示小分子肽有很强的呼吸活性，氧系数（QO2）≥4.0μLO2/（mg·h），刺激指数（SI）≥2.5，强于小牛血清去蛋白注射液。结论蛙血清小分子肽是一种新发现的肽，相对分子质量为1638，其药效可能优于小牛血清去蛋白注射液。

蛙血清；小分子肽；呼吸活性

研究表明，动物血清的主要药理活性成分是小分子肽［1］。笔者的前期研究发现蛙血清去蛋白提取物能提高心、脑组织对缺氧的耐受力［2］，能保护心、脑缺血再灌注损伤［3-4］，说明其含有对心脑缺血缺氧性损伤有保护作用的小分子肽类物质。因此，本研究从蛙血清去蛋白提取物中分离并纯化其中的小分子肽，鉴定小分子肽的分子质量，以期确定其分子结构和名称，并通过测定和计算小分子肽的呼吸活性和刺激指数（SI），探讨该小分子肽的药效。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性豚鼠1只，体重250～350 g，由广东医学院实验动物中心提供［合格证号：SYXK（粤）2013-0007］。

1.2 药品试剂

色谱纯乙腈（北京汇海科仪科技有限公司）；三氟乙酸（TFA，Sigma公司）；10%氢氧化钠溶液（分析纯，广州化学试剂厂）；Soerensen缓冲液（0.0667 mol/L）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O，分析纯，广州化学试剂厂）9.72 g和磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯，广州化学试剂厂）1.65 g加双蒸水至1000 m L，磷酸调pH值到7.4；Brodie测压液：取氯化钠（分析纯，广州化学试剂厂）23 g，牛胆酸钠（分析纯，北京化学试剂公司）5 g，伊文兰（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）100mg，加双蒸水至500mL；小牛血清去蛋白注射液（参考对照药，锦州奥鸿药业有限公司，规格：5mL∶0.2 g）。

1.3 仪器设备

光学显微镜（日本Olympus公司）；Ultraflex TOF/ TOF型MALDI-TOFMass（Matrix-assisted Laser Desorption/ioniza-tion time-of-flight）质谱仪（德国Bruker）；MILLIPORE8400超滤杯（MILLIPORE），RMM1000和RMM3000超滤膜（MILLIPORE）；SKW-3微量呼吸检压仪器（上海大学）；YQ3型高速匀浆机（江苏江阴县祝塘仪器厂）；恒温水浴箱（余姚电讯仪表实业公司）；旋涡混匀器（江苏海门麒麟医用仪器厂）。

1.4 蛙血清小分子肽的分离和鉴定

1.4.1 超滤蛙血离心取上清，乙醇去蛋白，蒸馏回收乙醇，得蛙血清去蛋白提取物。将其倒入超滤杯中进行超滤［5］。用截留相对分子质量为3000的超滤膜超滤，收集滤过液，再用截留相对分子质量为1000的超滤膜超滤，收集滤膜上保留液，低温保存。

1.4.2 RP-HPLC分离纯化分离柱：Sepax C18柱；洗脱液A为0.1%三氟乙酸（TFA）/H2O，洗脱液B为0.1%三氟乙酸（TFA）/乙腈；流速为1.0 mL/min，检测波长为215 nm，柱温箱温度为40℃。每次上样100μL，收集洗脱峰，用质谱仪鉴定洗脱峰中物质的分子量［6］。

1.4.3 质谱分析在MALDI-TOF/TOF Mass质谱仪上进行一级质谱（MS）和串联质谱（MS/MS）分析［6］。CCA基质：0.1%TFA、50%ACN、50%H2O。取1μL样品与3μLCCA基质混合均匀，取0.5μL混合液在按规律分别在板上点样，风干后送入机内检测。MS：正离子检测模式，离子源加速电压为20 kV，N2激光波长337 nm，脉冲宽度3 ns，离子延迟提取150 ns，真空度4×10-7Torr。转化MS/MS模式后，将满足MS的离子进行串联质谱分析，MS/MS模式的m/z范围为0～3000。

1.4.4 小分子肽的鉴定用Mascot软件的串级质谱数据和序列标签进行搜索鉴定［8］。

1.5 蛙血清小分子肽呼吸活性的测定

1.5.1 肝匀浆的制备雄性豚鼠1只，体重295 g，禁食24 h后颈椎脱臼处死，颈动脉放血，开腹取出肝脏，置冰水浴中的Soerensen缓冲液中。称取5.5 g的肝脏，并切割为大小相同的7块，每块用7 mL的Soerensen缓冲液匀浆。以上操作均在冰水浴中进行。

1.5.2 测定方法把测压计和反应瓶洗净，干燥。装好测压液于测压计内，调节液面至150 mm。准备供校正用温压计1套，空白组装置2套，对照组装置2套和供试品组装置2套。每个反应瓶中间小杯（内含1小滤纸条）加10%氢氧化钠溶液0.2mL。除供校正用温压计反应瓶只加Soerensen缓冲液2.5 m L外，其他每个反应瓶中均加入Soerensen缓冲液1.lmL和肝匀浆1.0 mL。空白组瓶中再加入Soerensen缓冲液0.2 m L，对照组瓶中加入参考对照药小牛血清去蛋白注射液0.2mL［9］，供试品组瓶中加入蛙血清小分子肽0.2mL。

将装好的密闭反应瓶与测压计相连，置37℃恒温水浴中。将测压计右侧柱液面调至150mm，记下左侧液面初读数（A），反应30min后将测压计右侧柱液面再调至150mm，记下左侧液面读数（B）。重复上述操作，进行下一个30 min的反应并记下左侧液面初读数（C）及30min后的液面读数（D）。实验过程中须观察供校正用温压计的压力的变化（ΔC），以消除试验过程中温度及大气压的影响［10］。取2.0mL肝匀浆，置恒重的装有海沙的称量瓶中，110℃干燥至恒重，计算两次的重量差ΔW（mg）。

1.5.3 计算呼吸活性计算公式［11］：QO2［μLO2/（mg·h）］=［（A-B+C-D）×K1-ΔC×K2］/G×I。公式中：QO2为氧系数；A、B、C、D为测压计的读数；K1为空白或样品的反应瓶常数；K2为温压计的反应瓶常数；ΔC为校正温压计的体积变化；G为每l毫升肝匀浆的干重，G=ΔW/2-9.3，9.3为Soerensen缓冲液的干重，单位mg；I为反应时间，单位h。

K1、K2计算公式为：｛［（VR+VM）×1000-2500］×273/（273+37）+2500×0.0239｝/10000。公式中：VR为反应瓶体积；VM为测压计体积；2500为瓶内液体体积（μL）；0.0239为37℃时氧的溶解度。

试验结果必须满足以下条件［12］：对照品组的QO2≥4.0μLO2/（mg·h）并且SI≥2.5；空白组的QO2≥1.0μLO2/（mg·h）。

2 结果

2.1 蛙血清超滤组分的RP-HPLC图谱

蛙血清超滤组分经RP-HPLC分离纯化，结果见图1。215 nm波长下，有7个洗脱峰。收集所有的洗脱峰。

2.2 蛙血清超滤组分洗脱峰的质谱图谱

将收集的RP-HPLC洗脱峰成分进行质谱检测，发现峰位22min的洗脱峰为高纯度肽。22min洗脱峰中相对分子质量为1638的肽的一级质谱图谱见图2，其相对应的二级质谱图谱见图3。

2.3 蛙血清小分子肽的数据库搜索鉴定结果

将相对分子质量为1638的小分子肽的二级质谱数据经处理后在数据库搜索，没有搜索到相关肽的信息，可能是新发现的肽。

图1 蛙血清相对分子质量1000～3000超滤组分的RP-HPLC图谱

图2 蛙血清相对分子质量1000～3000超滤组分RP-HPLC图谱上22 m in洗脱峰的MS图谱

图3 相对分子质量为1638的小分子肽的MS/MS图谱

2.4 蛙血清小分子肽的呼吸活性测定结果

检测的空白组、对照组及5组蛙血清小分子肽样品结果见表1，通过公式计算，得空白组的耗氧量为2.1［QO2≥1.0μLO2/（mg·h）］，对照组的耗氧量为6.4［QO2≥4.0μLO2/（mg·h）］，SI 3.0（≥2.5），均满足试验成功的条件。结果（表2）显示：蛙血清小分子肽的刺激指数大于小牛血清去蛋白注射液，表明蛙血清小分子肽比小牛血清去蛋白注射液的药效要更好。

表1 温压计、空白组、对照组和蛙血清小分子肽检测结果

表2 呼吸活性QO2值和刺激指数SI值

3 讨论

血清小分子肽是指血清中所有相对分子质量低于10 000的小分子蛋白质片段和多肽集合，具有低抗原等特性使其容易被吸收，并参与到细胞的新陈代谢中去，促进体内的新陈代谢［13］。但相对分子质量5000以下的血清小分子肽研究较少［14］，因为血清中大分子蛋白含量高，而且还与一些小肽结合在一起，使得分离纯化较难，而相对分子质量在1000～3000的肽含量虽少，但不与大分子蛋白结合，分离提纯比较容易［15］。

本研究选择两栖类的青蛙的血液进行研究，是考虑到蛙在冬眠时血液流动虽然很缓慢甚至停滞，但不会发生凝固和栓塞［16］，而秋冬寒冷季节人们脑梗塞的发病率更是明显升高，由此推测蛙血清中必定含有能维持细胞能量代谢的肽类物质，因此本研究在前期研究的基础上［3］，从蛙血清去蛋白提取物中分离相对分子质量为1000～3000间的小分子肽，鉴定其中纯度高的小分子肽的相对分子质量，以期确定其分子结构和名称。目前国内外对蛙血清的研究仅限于在血清生化指标方面的检测，尚未有在蛙血清中提纯小分子肽的相关研究报道，更无相对分子质量在1000～3000的小分子肽的研究。本研究通过RP-HPLC分离结果和质谱结果表明，蛙血清相对分子质量为1000～3000超滤组分中含有一种纯度高达99.2%的小分子肽，为22min洗脱峰中相对分子质量为1638的小分子肽，其他的洗脱峰纯度都不高，且混合存在多种小分子肽类物质，即使进行研究也无法说明其有效作用成分，所以必须选择高纯度的小分子肽进行研究。该小分子肽通过二级质谱分析，其二级质谱数据通过软件在蛋白质/肽类数据库中未检索到对应信息，也就是说很可能为新发现的一种小分子肽。研究后期将用Edman降解法测序，以期能获得这种小分子肽的氨基酸序列。

血清小分子肽生物活性的检测指标是呼吸活性和刺激指数［17］，可以反映出小分子肽对细胞的代谢作用［18］。本研究用豚鼠肝细胞为底物测定，用呼吸检压仪测定肝匀浆的呼吸活性和刺激指数。该检测系统简单灵敏专一，客观可靠［19］。检测结果显示，小分子肽的5个样品的刺激指数均符合国家规定标准（SI≥2.5），并且各样品的小分子肽的刺激指数均比小牛血清去蛋白注射液的刺激指数更高，说明小分子肽在促进细胞能量代谢和细胞修复方面的药效要优于小牛血清去蛋白注射液。

小分子肽类药物使用起来具有针对性强、疗效显著、副作用小等优点，成为新型药物开发的重要方向［20］。在本研究中，通过分离、提纯、鉴定，发现了蛙血清中的一种新的相对分子质量为1638的小分子肽，并检测了其呼吸活性和刺激指数，结果表明其药效要优于小牛血清去蛋白注射液。因此，若能将其开发应用，必定具有很好的社会效益。

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Isolation and identification and biological activity detection of small molecular peptides in frog serum

CHEN Bo1XIE Lin2▲
1.Laboratory of Physiology Science，Dongguan Campus of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Dongguan 523808，China；2.Basic Medical College，Dongguan Campus of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Dongguan 523808，China

Ob jective To isolated and identificated of small molecular peptide from the deproteinized frog serum extract，in order to detect its biological activity.Methods Collecting the components with relative molecular weight of 1000-3000 in frog serum was used ultrafiltration；separating and purificating the ultrafiltration components was used RP-HPLC；themolecularweight of smallmolecular peptideswas analyzed and identified by tandem mass spectrometry；the respiratory activity and stimulation index of liver cellsweremeasured and calculated by respiratory pressure detector.Results The second stagemass spectrometry data of smallmolecular peptide with relativemolecular weight of 1638 was disposed，and then itwas searched in the database，there was no relevant peptide information，maybe itwas a new discovery of the peptide.Detection of respiratory activity showed smallmolecular peptides had very strong respiratory activity，oxygen quotient（QO2）≥4.0μLO2/（mg·h），and stimulation index（SI）≥2.5，itwas stronger than in calf serum to protein injection.Conclusion The frog serum small molecular peptide is a newly discovered peptide，the relative molecular weight is 1638，the efficacy of the drug is better than that of calf serum albumin injection.

Frog serum；Smallmolecular peptide；Respiratory activity

R96

A

1673-7210（2016）05（a）-0016-05

2016-02-01本文编辑：苏畅）

广东医学院青年基金项目（Q2010003）；广东医学院大学生创新实验项目（2015ZYDS005）

▲通讯作者