高糖环境对内皮祖细胞成骨分化能力及其机制探讨

刘云平，刘勇，何延政

西南医科大学附属第一医院，四川泸州 646000

高糖环境对内皮祖细胞成骨分化能力及其机制探讨

刘云平，刘勇，何延政

西南医科大学附属第一医院，四川泸州 646000

目的观察高糖环境对内皮祖细胞成骨分化能力的影响，并对其机制进行探讨分析。方法采用密度梯度离心法分离及培养取得EPCs（内皮祖细胞），通过观察3组（对照组20 μg/mL、观察组60 μg/mL、实验组80 μg/mL）不同浓度高糖干预液对内皮祖细胞迁移、增殖及凋亡等功能产生的影响，并对成骨钙化基因进行相关检测，进而观察高糖环境对内皮祖细胞成骨分化能力所产生的影响。结果与对照组比较，观察组及实验组可明显抑制内皮祖细胞的迁移及增殖功能，加速其凋亡，可明显促进内皮祖细胞成骨分化，且观察实验组变化最为显著（P＜0.05）。结论高糖环境能明显抑制内皮祖细胞的迁移及增殖能力，加速其凋亡，可明显促进内皮祖细胞成骨分化；对深入研究糖尿病血管钙化机制有积极作用，为临床干预治疗提供新相关依据。

高糖环境；内皮祖细胞；成骨分化；糖尿病

近年来，随着我国生活水平的不断提高，糖尿病发病率呈明显上升趋势，而糖尿病致残及致死主要因素为糖尿病大血管并发症。内皮组细胞在血管内皮细胞的前端，它对于血管的重生再造和血管皮肤的复原都有着十分重要的意义，而高糖环境可导致内皮祖细胞数量急剧减少及迁移功能出现障碍，糖尿病大血管病变及并发症的出现与内皮祖细胞数量及功能出现紊乱有着密切联系；而血管钙化是糖尿病病人最容易出现的症状，它是主血管被破坏的罪魁祸首。学者讲过研究指出，血管钙化涉及到多种的细胞，病变过程极其复杂，但是它与人类骨骼的成长过程差不多，它是一种可以掌控的、自发的生物发展程序。血管钙化主要有两种病变情况：一个是动脉内膜呈现粥状的变硬，它的病理和脂质代谢紊乱极其类似，同时伴有发炎的情况。与此同时，内皮细胞遭到破坏，无法自动修复和免疫病毒，遭到破坏的损坏细胞会沉积于血管底部，最终导致组织贫血；另外一个是动脉中膜呈现线状的变硬，它在脂质沉积的部位和没有炎症的细胞软浸区极易发生，这些沉积物最后会堵塞胶原蛋白的末端，它和平滑肌的分离有很大的关系。该文通过观察高糖环境对内皮祖细胞成骨分化能力的影响，并对其机制进行探讨分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

CML-BSA购于美国Cell-Biolabs公司（货号STA-314），该产品不能直接使用，需要用PBS将其降低稀释。美国公司HyClones出出品的的DMEM/F12；美国公司GIBCO出品的胎牛的血清（FetalCalfSerum，FBS）；由美国赛摩科技公司（ThermoFisherScientific）出品的型号HERACELL150i的CO2类细胞的繁殖箱；流式细胞仪：美国BD公司，型号FACSCaliber；酶标仪：美国BioTek公司，型号ELx800NB；倒置显微镜：日本OLYMPUS公司，型号IX71-A12FL/PH。

1.2 方法

首先需要对一个健康的成人核细胞进行分解，所用的方法为EPSs分解繁殖不同密度离心法。经过此方法后，将有促进血管内皮发育的因子以及碱性纤维发育因子和10%的幼牛血清放入M199培养基进行放置，3 d之后除去没有贴壁的细胞，至于贴壁的细胞，将其继续添加生长银子，每3 d重新放置，等到第八天的时候贴壁细胞被消化吸收殆尽，这时使用激光式共聚焦显微镜额细胞仪进行分析。

1.3 分组

为对比、观察、实验（对比组20 μg/mL、观察组60 μg/mL、实验组80 μg/mL），每组进行实验/d。

1.4 衡量检测和所用方式

首先在EPCs96孔式的能力检测板上添加100微毫升两千个没有血清的细胞培养基，在经过1 d的同步之后，对他们进行不同的处理，每个小孔添加10 μL升LCCK-8液体继续繁殖2 h，酶标仪450 nm来检测对光感应程度，最后根据小孔和对比孔的对光感应程度分析出EPCs的增加数量。每一个小组必须做五次反复尝试。然后EPCs死亡能力相关测验将处理后的细胞加入195 μLAnnexinV-FITC结合液（1X）重悬细胞。加入5 μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育10 min，1000 g离心5 min，弃上清，加入190 μLAn-nexinVFITC组合水微微重新悬挂细胞。加入10 μmL碘化丙啶染色液体，慢慢地把他们摇匀，在低温中清晰尽量躲开阳光。随即进行流式细胞仪的检查。每组反复重新做五次。接下来是EPCs发育成功的骨头基因探测，该探测采用SYBRGreenI嵌合荧光法在illumna公司的E-coTM-Real.TimePCR仪上进行Real.TimePCR实验，所使用的试剂盒为SYBRPremixExTa qII（TliRNaseHPlus，TaKaRacode：DRR820），反应条件为预见变化95度30 s、PCR对应40个循环95度5 s60度30 s、溶解曲线式的解析和总结。最后是用统计学软件进行解析，计量单位用%表示，均数和标准差相等，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度高糖干预液内皮祖细胞迁移、增殖及凋亡情况比较

与对照组比较，观察组及实验组可明显抑制内皮祖细胞的增殖、迁移，促进其凋亡，其中实验组最为显著，差异具有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 各组内皮祖细胞迁移、增殖及凋亡情况比较

2.2 各组内皮祖细胞成骨分化基因表达情况比较

与对照组比较，观察组及实验组可明显增加内皮祖细胞成骨分化相关基因BMP2、ALP、RUNX2、OCN的表达，其中实验组最为显著，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表2。

表2 各组内皮祖细胞成骨分化基因表达情况比较

表2 各组内皮祖细胞成骨分化基因表达情况比较

组别例数BMP2ALP RUNX2OCN对照组观察给实验组8 8 8 6.51±0.29 3.89±0.25 7.05±0.39 1.69±0.24 2.45±0.14 12.98±0.011 1.11±0.09 3.01±0.21 10.13±0.39 3.43±0.08 4.49±0.11 10.01±0.29

3 讨论

血糖升高是糖尿病病理的重要标志，患者血糖控制良好与否直接关系到血管并发症的发病率；糖尿病患者一般情况下有血管并发症状，血管中最重要的内皮祖细胞大量减少，并且遭到毁灭性的损害，这意味着，糖尿病后期的血管病变症状与内阻皮细胞的总量联系密切，并且内皮祖细胞最大的敌人就是高血糖。除此之外，高血糖对细胞的破坏已经得到相关研究确定，很多种特殊情况都可以使得细胞被破坏。比如线粒体的激活，破坏相关基因的失衡，细胞的发育异变等等。从这次的实验可以看出，糖分过多可以回使得

EPCs大量死亡。因而，研究高糖环境对内皮祖细胞的迁移、增殖及凋亡等一些生物的特点的变化和相应的改变有很重要的作用。

综上所述，高糖环境能明显抑制内皮祖细胞的迁移及增殖能力，加速其凋亡，可明显促进内皮祖细胞成骨分化；对深入研究糖尿病血管钙化机制有积极作用，为临床干预治疗提供新相关依据。

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R587.1

A

1672-4062（2016）10（b）-0065-02

10.16658/j.cnki.1672-4062.2016.20.065

2016-07-26）

刘云平（1988.2-），男，四川成都人，硕士研究生，实习生，研究方向：血管外科。

何延政（1965.9-），男，四川巴中人，博士，副主任医师，研究方向：周围血管外科基础与临床。