UV法和UPLC法测定苦豆子总碱和苦参碱制剂光和热稳定性的比较研究

王 乔常建华吴树清曹晓东杨良月

(1.内蒙古农业大学 兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018;

2.内蒙古农牧业科学院,内蒙古呼和浩特 010031)

UV法和UPLC法测定苦豆子总碱和苦参碱制剂光和热稳定性的比较研究

王 乔1常建华2吴树清1曹晓东1杨良月1

(1.内蒙古农业大学 兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018;

2.内蒙古农牧业科学院,内蒙古呼和浩特 010031)

将苦豆子总碱和苦参碱制剂在不同的光和热条件下放置90d，用UV法和HPLC法对药物的光和热稳定性进行比较研究.方法：样品采用有机溶剂卒取，UV法测定药物含量，检测波长413nm，HPLC法采用SIGMADiscoveryC18柱（25cm×4.6mm，5μm），以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾（用磷酸氢二钾调PH至6.45）为流动相，波长220nm。比较药物浓度的RSD。结果：色谱图中峰分离良好。UV法的RSD值高于HPLC法，UV法产生的误差较大。结论：HPLC法比UV法测定方法重现性好，灵敏度好，精密度高。确定两种药物密封，4℃ 避光保存。

UV法UPLC法热稳定性

苦豆子（Sophora a1opecuroides）味苦性寒，多年生草本植物，旱生耐盐，抗风固沙作用强[3，7]。具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等作用。临床主要治疗家畜寄生虫病。同时在抗炎、抗病毒、抗肿瘤等方面具有广阔的应用前景[6、7]。剂型广泛，用途以一敌百。本试验根据《中国药典》（2010年版第二部）关于药物稳定性试验指导原则和制剂稳定性考察重点内容，本文通过UV法和HPLC法对苦豆子总碱和苦参碱制对光和热稳定性进行比较研究[8]。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

岛津LC-2010C高效液相色谱仪，SHB-ⅢA循环水式多用真空泵，KQ-700DV型数控超声波清洗器、SIGMADiscovery C18柱（25cm×4.6mm，5µm），旋涡振荡器。TU-1901双光束紫外分光光度计。

1.2 材料

原材料全部采样于鄂尔多斯市鄂托克前旗，采摘的苦豆子经内蒙古农业科学院兽医研究所化学提纯后得到苦豆子总碱和苦参碱制剂。甲醇、乙腈均采用色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 标准曲线的制备及绘制标准曲线

在UV法中，选取苦参碱作为苦豆子总碱和苦参碱制剂的标准品。精密称取苦参碱标准品0.005g，50m1容量瓶加入氯仿稀释至刻度，制成100mg/L母液，再用氯仿配制成不同浓度为2mg/ L、4 mg/L、8 mg/L、12mg/L1、14mg/L、16mg/L。在最大波413nm处，得到标准曲线Y=0.0558X-0.0326，R2＝0.9993，线性范围：1.8～15.9mg/L，作为UV法中两种药物标准曲线。

2.2 标准品溶液的制备及绘制标准曲线

2.2.1 苦豆子总碱标准品标准曲线的制备

在HPLC法中，选取槐定碱为苦豆子总碱制剂的标准品。精密称取槐定碱0.003g，用氯仿按1：10稀释。然后将其稀释至不同浓度为2.5µg/m1、3µg/m1、4µg/m1、5µg/m1、8µg/m1，得到标准曲线Y=466602X+94125R2=0.9998。线性范围2.473～8.005µg/ m1，作为HPLC法中苦豆子总碱标准曲线。

2.2.2 苦参碱标准品标准曲线的制备

在HPLC法中，选取苦参碱作为苦参碱制剂的标准品。将称取苦参碱标准品0.005g，用氯仿按1：10稀释，此时药物浓度为500µg/m L。将苦参碱标准品稀释成3µg/m L、5µg/m L、 10µg/mL、15µg/m L、20µg/mL，标准曲线Y＝12221X-20832，R2=0.9993，线性范围：3.116～19.997µg/mL，作为HPLC法中苦参碱标准曲线。

2.3 稳定性实验

将两种药物放置3个月（90d），装于密闭的容器内，通过UV法和HPLC法测定药物浓度的变化，进行比较研究。通过标准曲线方程得出测得的浓度。在每个月（30d）的第1d进行取样，测定药物浓度。

2.3.1 光稳定性试验

将两种药物分别放置在冷荧光灯和紫外灯下，冷荧光灯照度分别为3000LX、5000LX，紫外灯波长为254nm。

2.3.2 热稳定性试验

将两种药物放置在高温45℃、常温20℃、低温4℃三种不同温度下，不同温度组药物都用锡箔纸包裹用。

2.4 不同光照和温度条件组试验样品的处理

取2.3.1和2.3.2处理方法中的样品溶液1m1，加入9m1氯仿，离心4000r/15min，分离上清液和下清液，将上清液中加入9m1氯仿，离心4000r/15min，弃掉上清液，取下清液与之前的下清液混合，挥发干氯仿，得到试验样品。

3 UV法和HPLC法

3.1 UV法的处理过程

在2.4中的氯仿层中加入无水乙醇10m1，混匀，分别吸取20µ1于烧杯中，挥干乙醇，再加入10m1氯仿和10m1溴麝香草酚蓝显色剂，静置。两种药物都选定苦参碱为标准品，波长为413nm，显色剂为溴麝香草酚蓝。

3.2 HPLC法处理过程

将2.4中氯仿层中加入10mL 甲醇，用旋涡振荡器摇匀后，用甲醇溶液按（1：1000）稀释，充分摇匀.用0.45µm滤膜过滤稀释样品溶液并进样，此时为两种药物样品溶液.

（1）苦豆子总碱色谱条件：

SIGMADiscovery C18柱（25cm×4.6mm，5µm）。不同浓度洗脱，以甲醇：0.05mo1/L磷酸二氢钾（调PH至6.45）为流动相，0min～4min（15：85～18：82），4min～10min（12：82～25：75），10min～13min（25：75～20：80），13min～20min（20：80～15：85），波长225nm，柱温40℃，流速0.8m1/min，进样量20µ1，进样时间25min。

图1　槐定碱标准品色谱图

图2　苦豆子总碱制剂样品色谱图

槐定碱:SIGMA DiscoveryC18柱(25cm×4.6mm,5μm),选定槐定碱为标准品以甲醇-0.05mol•L磷酸二氢钾(用磷酸氢二钾调PH至6.45)=35∶65,波长220nm,柱温35℃,进样量20μL,进样时间15min为条件.苦参碱标准品和样品色谱条件同槐定碱。

图3　苦参碱标准曲线色谱图

图4　苦参碱制剂样品色谱图

3 结果与分析

表1　不同温度下总碱和苦参碱的测定浓度

在4℃避光放置期间，苦豆子总碱和苦参碱制剂浓度降低最慢。浓度变化比较稳定，在45℃避光放置期间，药物浓度降低最快。苦豆子总碱和苦参碱制剂在不同温度下，浓度变化差异显著（P＜0.05）. 根据试验结果，在不同温度下，苦豆子总碱和苦参碱制剂浓度差异显著，在4℃浓度，浓度最高，在45℃，浓度最低。4℃和20℃时、4℃和45℃，25℃和45℃苦豆子总碱和苦参碱浓度显著降低（P＜0.05）。

表2　不同光照下总碱和苦参碱的测定浓度

在不同光照下，苦豆子总碱在冷荧光灯下，不同照度时，浓度差异显著（P＜0.05）。冷荧光灯组和紫外灯组浓度差异显著（P＜0.05），在紫外灯照射下，苦豆子总碱在30001x和50001x、50001x和紫外光时，浓度显著降低，降低不显著。苦参碱在30001x和紫外光、50001x和紫外光时浓度显著降低，在30001x和50001x时浓度降低不显著。

表3　避光条件下不同仪器测定总碱和苦参碱浓度的比较

在避光条件下，不同仪器测定苦豆子总碱和苦参碱制剂浓度差异显著（P＜0.05）。

4 讨论

药物对光和热比较明显，在不同条件下，浓度均有降低，温度越高，药物浓度降低越快。药物在紫外光中浓度降低最快。初步确定最适宜4℃、避光保存。

在HPLC法测定苦豆子总碱制剂样品中，样品中各成分在图2色谱图中分离良好，在不同时间中出现4个峰，依次为溶剂峰、槐定碱、氧化苦参碱和苦参碱。其中以槐定碱的浓度最高，所以选定槐定碱的浓度作为苦豆子总碱的浓度，应用此法成功地建立了苦豆子总碱和苦参碱制剂的检测方法。

样品的前期处理过程一样，只是仪器的工作原理不同，使检测结果的差异较大。根据表3，HPLC法比UV法的RSD值要小，说明HPLC法的精密度较高，HPLC法侧重于药物的分离，并且能够较精准的测定物质含量。将药物中提取出的成分通过仪器的高效、高灵敏度的测定，并快速分析。

UV法利用药物在不同波长下的对光吸收的差异，定量分析。在定量分析中，会产生光谱干扰，对于检测结果偏差较大，只选用这一种方法，并不能够达到检测目的。用两种方法对比，HPLC法精密度较高，便于分离和测定，更适合中药含量的测定。

[1] 付红，于泽源.樱桃红色素光和热稳定性的研究[J].食品科技，2004，（5）：40-41，49.

[2] 刘喜纲，刘翠哲，常金花.应用酸性染料比色法测定总生物碱的含量[J].中国药房，2007，（11）：875-876.

[3] 宋玉琴，魏玉辉，武新安. RP-HPLC法测定苦豆子总碱注射液中槐定碱、苦参碱和槐果碱的含量[J].兰州大学学报（医学版），2007，（4）：24-26.

[4] 孙健，马吉胜，金瑾，王等.黄连解毒汤各成分的HPLC-UV/MS定性与定量测定方法研究[J].药学学报，2006，（4）：380-384.

[5] 王静，韩正洲，杨立伟，等. HPLC和UPLC法对比测定千里香药材中九里香酮的含量[J].药物分析杂志，2010，（8）：1499-1501.

[6] 杨巧丽，顾政一，黄华.中药苦豆子的研究进展[J].西北药学杂志，2011，（3）：232-236.

[7] 李艳艳，冯俊涛，张兴，等.苦豆子化学成分及其生物活性研究进展[J].西北农业学报，2005，（2）：133-136，140.

内蒙古农牧业科技创新项目（2011CCJJM05）

王乔（1989－），女，硕士研究生，研究方向：反刍动物抗病性研究。

吴树清（1957－），男，教授，硕士，硕士生导师，研究方向为反刍动物抗病性能研究。常建华（1959-），内蒙古农牧业科学院研究员。