消痰通腑方对肥胖氧化偶氮甲烷

顾雨芳 刘煊 李勇进 等

消痰通腑方对肥胖氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠模型小鼠血清白介素-6和脂联素的影响

顾雨芳 刘 煊 李勇进 修丽娟 魏品康

上海长征医院中医科，上海 200003

[摘要] 目的 观察消痰通腑方对肥胖氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）模型小鼠成瘤率及血清白介素-6（IL-6）、脂联素（ADP）的影响。 方法 饲喂高脂饮食建立小鼠肥胖模型，设正常对照组、肥胖对照组、肥胖模型组及肥胖中药组，各6只。肥胖模型组及肥胖中药组第1天AOM 12.5 mg/kg腹腔注射，第2天开始饲喂含3.5%DSS饮水7 d，之后改为14 d正常饮水为1个循环，共循环3次。正常对照组及肥胖对照组腹腔注射等剂量生理盐水及正常饮水。模型建成后，肥胖中药组给予灌胃消痰通腑方0.4 mL/d，共4周，其余各组灌胃等剂量蒸馏水。实验结束后观察小鼠成瘤率及血清IL-6和ADP的变化。 结果 肥胖中药组成瘤率（50%）明显低于肥胖模型组（100%）（P < 0.05）。肥胖中药组血清IL-6水平为（128.17±8.55）ng/L，明显低于肥胖模型组的（145.45±11.39）ng/L（P < 0.05）。肥胖中药组ADP水平为（81.05±7.34）μg/L，明显高于肥胖模型组的（63.15±10.37）μg/L（P < 0.05）。 结论 消痰通腑方可降低肥胖AOM/DSS模型小鼠的成瘤率及血清IL-6水平，升高ADP水平。

[關键词] 消痰通腑方；肥胖；结直肠癌；白介素-6；脂联素

[中图分类号] R289 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（a）-0016-04

Effect of Xiaotan Tongfu Presciption on serum interleukin-6 and adiponectin in AOM/DSS model of obese mice

GU Yufang LIU Xuan LI Yongjin XIU Lijuan WEI Pinkang

Department of Traditional Chinese Medicine， Shanghai Changzheng Hospital， Shanghai 200003， China

[Abstract] Objective To observe effect of Xiaotan Tongfu Presciption on tumor rate， serum interleukin-6 （IL-6） and adiponectin （ADP） in Azoxymethane （AOM）/Dextran Sodium Sulfate （DSS） model of obese mice. Methods Feeding high fat diet to establish the model of obesity in mice. The mice were randomly divided into normal control group， obese control group， obese model group and obese Chinese medicine group， each group of 6 mice. The mice in obese model group and obese Chinese medicine group were injected AOM 12.5 mg/kg intraperitoneally on the first day and fed with 3.5%DSS from the second day for 7days， then changed to 14 days of normal drinking water as 1 cycle， repeat 3 cycles. The mice in normal control group and obese control group were injected with the same dose of normal saline and normal drinking water. After the model was built， mice in obese Chinese medicine group were given intragastric administration： Xiaotan Tongfu Presciption 0.4 mL/d， a total of 4 weeks， the remaining groups were intragastric administration of the same dose of distilled water. The tumor rate and the changes of serum ADP and IL-6 were observed. Results The tumor rate of obese Chinese medicine group （50%） was significantly lower than that of obese model group （100%） （P < 0.05）. Serum IL-6 level of obese Chinese medicine group was （128.17±8.55） ng/L， significantly lower than that of obese model group [（145.45±11.39） ng/L] （P < 0.05）. ADP level of obese Chinese medicine group was （81.05±7.34） μg/L， significantly higher than that of obese model group [（63.15±10.37） μg/L] （P < 0.05）. Conclusion Xiaotan Tongfu Presciption can reduce the tumor rate and IL-6 level， increase ADP level in AOM/DSS model of obese mice.

[Key words] Xiaotan Tongfu Presciption； Obesity； Colorectal cancer； Interleukin-6； Adiponectin

随着经济水平的提高，我国结直肠癌的发病率和死亡率逐年上升[1]。近期研究表明，肥胖是结肠癌的一个危险因素[2-3]，且增加其死亡率[4]，结肠癌亦属于肥胖相关性肿瘤。寻找预防及治疗结直肠癌的药物或方法具有重要意义。前期研究显示，消痰通腑方可抑制小鼠结肠癌CT26原位移植瘤的生长，抑制肝脏转移[5]。笔者正在进行的实验显示，消痰通腑方有抑制化学诱导结肠癌发生的作用。本实验选择氧化偶氮甲烷（Azoxymethane，AOM）/葡聚糖硫酸钠（Dextran Sodium Sulfate，DSS）诱发的炎症相关性肠癌肥胖小鼠模型，采用消痰通腑方干预，观察其对模型小鼠血清炎性因子及脂联素（adiponectin，ADP）水平的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与饲料

动物：健康清洁级C57BL/6小鼠，28只，雄性，4周龄，体重（20±2）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2012-0002；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2012-0003。自由进食、饮水，环境温度（22±3）℃，相对湿度40%～55%，每天光照12 h。

饲料：基础饲料及40%高脂饲料由上海普路腾生物科技有限公司提供，许可证号：沪饲证：（2014）04001。小鼠饲料配方：基础饲料47%，水分10%，粗蛋白质20.5%，粗脂肪4%，粗纤维5%，粗灰分8%，钙1.8%，总磷1.2%，赖氨酸1.32%，蛋氨酸+胱氨酸0.78%，氯化钠0.4%。高脂饲料配方：基础饲料41.79%，猪油40%，胆固醇1%，蛋黄粉12%，胆盐0.2%，蔗糖5%，甲基硫氧嘧啶0.01%。

1.2 药物

消痰通腑方，主要由制半夏、制大黄、白芍、细辛等组成，由第二军医大学长征医院监制江阴天江药业有限公司生产，批号：1011370。

1.3 试剂与仪器

试剂：氧化偶氮甲烷购自Sigma公司，批号：A5486；葡聚糖硫酸钠购自常州千杏生物科技有限公司，批号：DB0160；白介素-6（IL-6）的ELISA试剂盒购自美国Rapidbio公司，批号：DRE30044；脂联素试剂盒购自美国RB公司，批号：201412。

仪器：离心机由上海安亭科学仪器厂制造，型号：TDL80-2C；移液器、离心管由Eppendorf公司提供。

1.4 分组、造模与给药

28只小鼠，适应性喂养1周后，随机分为：正常对照组（6只）及肥胖造模组（22只）。正常对照组予基础饲料喂养，肥胖造模组予高脂饲料喂养，每周测体重1次并记录。根据人类肥胖标准，将体重≥标准体重的20%视为肥胖[6]。当肥胖造模组小鼠平均体重>正常对照组的20%定义为肥胖模型建成，剔除体重最轻的4只小鼠。采用随机数字表法，将剩余的肥胖造模组小鼠分为肥胖对照组、肥胖模型组及肥胖中药组，各6只。肥胖模型组及肥胖中药组第1天AOM 12.5 mg/kg腹腔注射，第2天开始饲喂含3.5%DSS饮水7 d，之后改为14 d正常饮水为1个循环，共循环3次9周时间。正常对照组及肥胖对照组腹腔注射等剂量生理盐水及正常饮水。第14周开始，肥胖中药组小鼠灌胃消痰通腑方0.4 mL/d，共4周，其余各组灌胃等剂量蒸馏水。18周后所有小鼠脱颈椎处死。

1.5 观测指标

每日观察小鼠形体、精神状态及粪便等一般状况。实验结束后，摘眼球取血，血标本静置20 min后，3000 r/min离心20 min，分离血清，-80℃保存，用ELISA检测血清IL-6及ADP指标。小鼠以颈椎脱臼处死，迅速剖取整段结直肠（自盲肠末端至肛门），并沿肠管纵轴纵向剖开，用预冷的生理盐水溶液漂洗清洁，黏膜面朝上置于滤纸上，肉眼观察黏膜炎症及有无肿瘤的发生及肿瘤发生数目。选取红肿糜烂、溃疡或肿瘤较明显处的病变肠段置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋，切片，苏木精-依红（HE）染色，行病理组织学检测。计算肿瘤发生率：肿瘤发生率=（腺癌+腺瘤）动物数/动物总数×100%。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较，方差齐时用LSD-t检验，方差不齐时用Dunnett′s T3检验，以P < 0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况

11周时，喂养高脂饲料的肥胖造模组小鼠体重为（30.75±1.29）g，超过正常对照组小鼠体重[（25.75±0.66）g]的20%，肥胖模型建成，肥胖模型组及肥胖中药组小鼠建立AOM/DSS模型。正常对照组小鼠形体正常，行动灵活，大便正常；肥胖对照组体型肥胖，运动迟缓，大便正常；肥胖模型组小鼠体型肥胖，进食减少，排稀便；肥胖中药组小鼠毛發油亮，体型肥胖，进食较肥胖模型组增加，排稀便减少。消痰通腑方可增加小鼠的食欲，减轻腹泻情况。

2.2 消痰通腑方对小鼠肿瘤发生的影响

结肠组织肉眼观察发现，正常对照组及肥胖对照组小鼠肠黏膜未见明显异常，肥胖模型组小鼠肠黏膜可见较多息肉状隆起样改变，肥胖中药组小鼠肠黏膜息肉状隆起样改变数目明显减少，见图1。病理检查可见，正常对照组及肥胖对照组小鼠结肠黏膜未见明显异常；肥胖模型组小鼠结肠可见黏膜腺体萎缩，低级别上皮内瘤变及高级别上皮内瘤变未见浸润性癌，荷瘤数目为（9.50±3.27）个，成瘤率为100%；肥胖中药组小鼠息肉数目明显减少，荷瘤数目为（5.83±2.31）个，成瘤率为50%，与肥胖模型组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、表1。

A

B

C

D

A：正常对照组；B：肥胖对照组；C：肥胖模型组；D：肥胖中药组

图1 各组肠黏膜肉眼观察

A B

C D

A：正常对照组；B：肥胖对照组；C：肥胖模型组；D：肥胖中药组

图2 各组肠黏膜病理表现（HE染色，100×）

表1 各组小鼠荷瘤数目及肿瘤发生率比较

注：与肥胖模型组比较，△P < 0.05

2.3 各组小鼠血清IL-6及ADP水平比较

肥胖模型组小鼠IL-6水平明显高于肥胖对照组及正常对照组（P < 0.01），肥胖中药组小鼠IL-6水平低于肥胖模型组（P < 0.05）；肥胖模型组小鼠ADP水平明显低于肥胖对照组及正常对照组（P < 0.01），肥胖对照组小鼠ADP水平明显低于正常对照组（P < 0.01），肥胖中药组小鼠ADP水平高于肥胖模型组（P < 0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血清IL-6及ADP水平比较（x±s）

注：与正常对照组比较，**P < 0.01；与肥胖对照组比较，##P < 0.01；与肥胖模型组比较，△P < 0.05；IL-6：白介素-6；ADP：脂联素

3 讨论

近年来人们生活方式的改变如活动量减少、高脂高糖饮食摄入增加，使肥胖的发病率越来越高。一项Meta分析结果显示，体重指数每增加2 kg/m2，结直肠癌的危险度增加7%[7]。肥胖是结直肠癌发生的一项独立危险因素。肥胖与结肠癌发病的确切机制还没有完全明了。在肥胖状态下，以下因素的改变可能在结肠炎癌变的发展中起重要作用，包括胰岛素、瘦素、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及IL-6的增加和ADP的减少[8-9]。

IL-6是一种重要的促炎细胞因子，不仅由单核/巨噬细胞产生，也由脂肪细胞产生，在肥胖状态下，血清IL-6水平增加[10]。近年来研究显示，IL-6及其相关信号通路参与了结肠癌的发生，IL-6可在早期促进癌变细胞的增殖和肿瘤细胞的增长[11-12]。

ADP是脂肪组织分泌的脂肪细胞因子中，唯一随脂肪组织体积增大而血浆浓度降低的脂肪因子，有胰岛素增敏、抗炎和抗凋亡的作用，与肥胖、2型糖尿病、心血管疾病和肿瘤等疾病的发生、发展密切相关[13]。ADP可能通过与受体结合后介导PI3K/Akt/mTOR、Wnt等信号通路或通过调节其他细胞因子如瘦素、TNF-α、IL-6等影响肠癌的发生、发展[14]。动物实验显示，在AOM诱导的大肠癌模型中，ADP基因敲除小鼠的大肠癌生成和肝转移较野生型小鼠更多[15]。体外实验表明，ADP分泌的受损可引起结肠干细胞数量减少及细胞凋亡增加，导致结肠癌的发生[16]。有前瞻性病例对照研究显示，低血浆ADP的男性患大腸癌风险更高[17]。增加循环ADP的水平或活化ADP介导的信号通路则有抗肿瘤的作用[14]。

AOM/DSS模型是目前使用最广泛的结直肠癌化学诱导模型[18]。Suzuki等[19]用AOM 10 mg/kg腹腔注射和含1%DSS饮水4 d的方法处理雄性C57BL/6小鼠，第18周发现小鼠结肠腺癌发生率为50%。本研究预实验显示，给正常体重C57BL/6小鼠AOM 12.5 mg/kg腹腔注射3次联合3循环3.5%DSS自由饮用，肠黏膜上皮最早于第9周出现结直肠高级别上皮内瘤变，14周时成瘤率为83.33%，其中50%为高级别上皮内瘤变，至18周成瘤率达90%[20]。本研究用AOM/DSS三循环的方法诱导肥胖小鼠建立模型，成瘤率达100%，肥胖模型组小鼠均出现高级别上皮内瘤变，表明肥胖可增加AOM/DSS模型的成瘤率。

魏品康[21]教授认为，“痰”是消化道肿瘤的主要致病因素，这种“痰”是广义的“痰”，指脏腑功能失调或疾病状态下津液水湿代谢障碍产生的病理产物，痰生成后，蓄积于体内，日久局部微环境发生变化，此即“痰浊”；在某些因素如“气”和“火”的作用下，痰聚成结，化生痰核，萌生痰络，生为“恶痰”即消化道肿瘤。早在《内经》时代，中医就将肥胖之人称为“肥人”，认为肥胖症与痰湿密切相关。饮食肥甘，脾胃运化失健，传导失司，水谷停为湿滞，蕴久化热，湿与热结发为肠澼，湿热留滞于大肠，与气血博结，致肠道传导失司，产生气滞、血瘀、痰浊等病理改变，形成结肠癌的基础。结肠癌的发生与痰阻、气滞、血瘀、热毒相关，其中痰浊内阻是肿块形成的关键病机。肥胖为一种慢性炎症状态，脂肪组织分泌大量的炎性因子如IL-6、TNF-α[4]，而ADP水平则显著降低，干扰机体内环境的稳态，为肠癌的发生提供了痰浊环境，如果清除这种环境则能抑制其发生、发展。所以，从痰论治，清化痰浊污染，以消痰散结、清热通腑之法治之。消痰通腑方是以魏品康主任消痰散结八法中消痰散结导滞法为指导，以二陈汤和小承气汤化裁而来，在临床实践中，治疗结肠癌效果甚佳。

本实验结果显示，肥胖对照组的IL-6水平与正常对照组比较，差异无统计学意义（P > 005），但从数据看有增高趋势；肥胖模型组的IL-6水平较正常对照组及肥胖对照组明显升高（P < 005）；肥胖对照组小鼠ADP水平较正常对照组明显降低（P < 005）；肥胖模型组小鼠ADP水平较正常对照组及肥胖对照组明显降低（P < 005）；经消痰通腑方干预后可降低肥胖中药组的成瘤率及IL-6水平，升高肥胖中药组的ADP水平。降低炎性因子的水平及提高ADP的水平，都能降低肿瘤的发生率。本研究为从痰论治结肠癌提供了新的证据，但其具体作用机制尚待进一步研究。

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（收稿日期：2015-10-27 本文编辑：李亚聪）