不同通气条件对土壤中丝状真菌类型的影响

夏　宇 

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南　长沙 410128）

不同通气条件对土壤中丝状真菌类型的影响

夏宇

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128）

以不同通气条件处理的水稻田土壤为材料，通过稀释涂布平板法筛选得到11株菌株；提取这些菌株的克隆保守序列（ITS序列）并对其进行扩增、测序、分析，并建立系统发育树，鉴定这些菌株的种属名称。结果表明：这11株菌株分属于真菌和放线菌两大类，其中丝状真菌又分为曲霉和枝孢霉两类，其中青霉属、曲霉属亲缘关系最接近。从通气处理对土壤中丝状真菌类型的影响结果可知，对水稻最有益的通气方式为白天通气两次、在移栽前和分糵期通入0.3‰的H2O2。

丝状真菌；稻田土壤；IST序列分析；系统进化树

水稻是我国主要的粮食作物，而大部分时间水田土壤是被水覆盖的，因此水稻田土壤中的微生物类型及其活动与旱地的有较大区别。而土壤通气状况对农田微生物区系、土壤微生物生物量以及植物-微生物共同体（内生菌根、根瘤及其与微生物）的活动等都有显著影响，从而间接影响作物的产量[1]。

丝状真菌（filamentous）俗称霉菌（moulds），广泛分布于土壤、水域、空气及动植物体内外，在潮湿的气候下大量生长繁殖，长出肉眼可见的丝状、绒状或蜘蛛网状的菌丝体。霉菌对人类生活有较大危害。例如：许多霉菌会造成农作物和植物的病害；可引起农产品、纺织品、食品和其他工业产品的发霉变质，造成严重的经济损失；还有的真菌能产生毒素，使人畜中毒，黄曲霉（Aspergillus flavus）产生的黄曲霉素（alfatoxin）就是典型的真菌毒素，具有较强的致癌作用[2]。

试验模拟水稻田环境，通过预设管道对稻田土壤进行不同的通气处理，研究在水稻栽培过程中不同通气处理对土壤中丝状真菌类型的影响，以期对作物栽培过程中改善生态环境起指导作用。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试材料及试剂供试稻田土壤从湖南省农业科学院附近的水稻田采集。供试水稻品种为深两优876。试验试剂有DNA提取试剂盒、裂解缓冲液（0.4 mol/L Tris-HCl，0.06 mol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，1%SDS，pH值8.0）、变性液（3 mol/L KAc，pH值4.6）氯仿、异丙醇、TE缓冲液、DNA标准分子量标记物、琼脂糖、1×电泳缓冲液TBE、6×样品缓冲液、溴化乙锭等。土壤中真菌采用土豆固体培养基培养。

1.1.2仪器设备培养皿、封口膜、试管、移液枪、锥形瓶、玻璃珠、恒温培养箱、载玻片、显微镜、试管架、酒精灯、超净工作台、镊子、接种环、PCR仪、冷冻离心机、研钵、吸水纸、水平板电泳槽、灌胶模具及梳齿、电泳仪、水浴锅等。

1.2试验方法

1.2.1通气处理（1）水稻种子催芽。将超级水稻种子放入培养皿中，置于35℃恒温培养箱中浸水培养5～6 d，期间每天早晚换水一次，直到水稻种子长出白色新芽。（2）移栽。将带芽水稻种子移栽至稀泥中，长出水稻苗后转移到玻璃大棚中进行栽培，并采用不同的方式对水稻土壤进行通气，详见表1。

表1　水稻培养中采用的不同通气条件

1.2.2取样取样的时间为上午8:00～10:00，取距离土壤表面5 cm，靠近根部的土壤约10 g，并标记编号。

1.2.3典型代表菌种的挑选分离土壤中的微生物后选择其中的丝状真菌进行纯化。经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种。将分离培养所得的纯丝状真菌菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上，保存备用。观察并记录菌种的保存与生长状况[3]。

1.2.4真菌总DNA的提取及ITS序列克隆测序（1）提取。参照何水林[4]的方法提取真菌总DNA。（2）ITS序列扩增。选用ITS通用引物[5]（ITS1：5'-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3'，由华大基因公司合成）进行PCR扩增。反应体系（25 μL）：引物（100 μmol/L）1 μL，模板1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反应程序：95℃，3 min；94℃，1 min，54℃，45 s，72℃，45 s；35个循环；72℃，10 min。PCR产物于4℃保存。（3）PCR产物电泳。配制1%琼脂糖凝胶，PCR产物上样后在100 V恒压下电泳20 min。电泳完成后，于凝胶成像系统中观测是否获得大小相当的目的片段[6]。（4）目的片段回收及测序。按何水林[4]的方法回收目的片段，送华大科技公司测序。

1.2.5生物信息学分析将测序结果与BLAST核酸数据库进行比对分析，在所得分类报告的结果中取得分最高的序列（相似度均超过99%）作为种属鉴定参照序列，供试真菌样品的种属分类按参照序列确定，以此构建出 11种丝状真菌ITS序列的系统进化树。

图1　各菌种的表观特征

2　结果与分析

2.1不同通气处理对水稻土中真菌类型的影响

试验结果显示，除T2和T8处理以外，其他处理均分离得到1种或2种丝状真菌。其中，T3、T5、T7、T9和CK处理分别得到1种真菌，编号分别为M11、M2、M6、M4和M8；而T1、T4、T6处理均分离得到两种真菌，编号分别为M7和M9、M1和M3、M5和M10。各真菌表观特征如图1所示，经初步鉴定，M1～M11分别为烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、黄曲霉菌（Aspergillus flavus）、烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、M4 草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）、枝孢菌菌（Cladosporium）、烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、芽枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）、桔青霉素菌（Penicillium citrinum）、尖孢枝孢霉菌 （Cladosporium oxysporum）、链霉菌（Streptomyces）和棘孢曲霉菌（ Aspergillus aculeatus）。

2.2各菌种ITS序列克隆结果

由于试验克隆的是丝状真菌的ITS序列，而真菌ITS区域长度一般在650～750 bp，因此采用1%浓度的凝胶分离得出了比较理想的效果。PCR扩增后，所有样品的PCR产物经凝胶电泳显示均能扩增出目的条带，扩增产物大小在500～750 bp之间（图2），可以看出目的条带非常清晰，所有真菌通过PCR扩增出来的DNA样品的目标带都一致，且分子量大小相近，11个样品都比较干净，杂带和降解现象都不明显。因此可以初步断定该方法可行，扩增产物可用于序列测定。

图2　各菌种PCR产物的凝胶电泳（1～11分别为M1～M11的PCR产物）

2.3ITS序列序列生物信息学分析

根据BLAST核酸数据库所得分类报告的结果，取每个报告中得分最高的序列（相似度均超过99%）作为种属鉴定参照序列，供试真菌样品的种属分类按参照序列确定，分类结果如表2所示。

2.4各菌种的发育系统进化树

表2　各菌株的序列比对结果及其种属鉴定分析

构建出11种丝状真菌ITS序列的系统进化树（图3），系统关系图显示分离出的丝状真菌的亲缘关系比较接近，只有M10与其他的丝状真菌亲缘关系较远。根据遗传距离可以将11个菌株分为 3个类群。

图3　丝状真菌菌株系统关系图

其中，M1、M2、M3、M4、M6、M8、M11为同一类群——A群。种属鉴定分析显示：M1、M2、M3、M6、M11为曲霉属，M4、M8为青霉属，青霉属和曲霉属同属于曲霉科的常见属，区别仅仅是：曲霉属的孢子梗是辐射状排列，呈头状，分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，一般呈球形，顶囊表面长满一层或两层辐射状小梗（初生小梗与次生小梗），最上层小梗瓶状，顶端着生成串的球形分生孢子；而青霉属分生孢子成帚状，从菌丝体伸向空中，各顶端的小梗产生链状的青绿—褐色的分生孢子，分生孢子顶端无膨大。图3中显示同属于烟曲霉的M1、M3、M6亲缘关系最近，而属于棘孢曲霉菌的M11亲缘关系最远。

M5、M7、M9为同一类群——B群，种属鉴定分析显示M5为枝孢霉菌，M7为芽枝状枝孢菌，M9为尖孢枝孢霉菌，都为枝孢霉属，亲缘关系非常接近。枝孢菌能够产生分生孢子，是暗色孢科的一种，室内和室外都比较常见，颜色为深绿色，因此经常与曲霉菌弄混。其实，枝孢菌与曲霉菌的区别主要在于枝孢菌的菌丝也带有颜色，菌落整体呈现深色。

M10单独为一类群——C群，通过种属鉴定分析为链霉菌，链霉菌属有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化为营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。营养菌丝又名基内菌丝，色浅，较细，具有吸收营养和排泄代谢废物的功能；气生菌丝是颜色较深、直径较粗的分枝菌丝；气生菌丝成熟分化成孢子丝，孢子丝再形成分生孢子。链霉菌是最高等的放线菌，不属于真菌，因此与其他10种菌的亲缘关系非常远。

由以上分析可将不同通气条件下丝状微生物分为两大类：真菌和放线菌。其中丝状真菌又包含曲霉和枝孢霉两类。

3　讨　论

rNDA-ITS序列分析可以初步断定不同通气条件下，土壤中丝状真菌的大致分类地位，分析结果显示各真菌的亲缘关系比较接近，绝大多数都属于丛梗孢目下的分支。这一结果表明丛梗孢目微生物可能是通气土壤中真菌微环境构成要素。试验分离得到的丝状真菌对动物、植物都有不同程度的危害。

（1）烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）：该菌为致病菌，能引起人、畜和禽类的肺曲霉病及其他疾病，可侵染棉铃和苹果等，引起果实腐烂，或将孢子寄藏于种子上引发棉铃曲霉病等[7-8]。

（2）黄曲霉菌（Aspergillus flavus）：该菌的主要危害在于其代谢产物——黄曲霉毒素。研究表明，除了致癌作用以外，黄曲霉毒素的毒性作用主要与抑制蛋白质合成有关，其分子结构中的双呋喃环是产生毒性的主要原因；另外，黄曲霉毒素的细胞毒作用主要是干扰信息RNA和DNA的合成，进而干扰细胞蛋白质的合成，导致动物全身性损害[9]。因此，我国规定大米、食用油中黄曲霉毒素允许量标准为10 μg/kg，其他粮食，豆类及发酵食品为5 μg/kg，婴儿代乳食品不得检出。

（3）青霉菌（Penicillium）：该菌代谢产物青霉素是抗菌素的一种，含有青霉烷，能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。

（4）枝孢菌（Cladosporium）：枝孢菌不会产生任何对人体的直接毒素，但是枝孢菌孢子是一种广泛的过敏原，会引发哮喘病人发作或有类似呼吸系统疾病患者的过敏反应；另外某些枝孢属菌种可以引起人类感染，如枝状枝孢可引起皮肤暗色丝孢霉病，多主枝孢可引起着色芽生菌病和皮肤暗色丝孢霉病等[10]。

综上所述，在水稻种植过程中对土壤采取不同的通气处理，可影响土壤中的微生物类型，进而对水稻的生长发育产生一定影响。其中，白天通气产生的真菌比晚上通气产生的真菌数量少；一日通气两次比一日通气一次和两日通气一次产生的真菌少；灌浆期使用H2O2处理会使产生的丝状真菌变多。其他时期，如移栽前和分蘖期用H2O2处理对水稻的影响不大。因此，对水稻栽培最有益的通气方式为：白天采用排气量50 L/min的空气泵通过土壤中事先埋设的PVC塑料软管向土壤根际输气4 min，输气时间采用定时器确定在每天8:00，17:00；同时，可在移栽前和分糵期采用同样的空气泵通过土壤中埋设的PVC塑料软管向土壤根际输入0.3‰的H2O2。

[1] 李 元，牛文全，张明智，等. 加气灌溉对大棚甜瓜土壤酶活性与微生物数量的影响[J].农业机械学报，2015，（8）：121-129.

[2] 周德庆. 微生物学教程[M]. 北京：高等教育出版社，2011.

[3] 周德庆. 微生物学实验教程[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

[4] 何水林. 基因工程[M]. 北京：科学出版社，2008.

[5] 陈剑山. ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用[J]. 安徽农业科学，2007，35（13）：3785-3786，3792.

[6] 王金婷. 生物化学实验教程[M]. 武汉：华中科技大学出版社，2010.

[7] 刘 华，贺湘玲. 侵袭性曲霉菌感染现状及实验室研究进展[J]. 医学临床研究，2014，（11）：2262-2264.

[8] 史先英，韩宏分. 棉花铃病的发生及其防治对策[J]. 中国棉花，2007，（2）：28.

[9] 赵玲玲 都启晶 王世清，等. 黄曲霉毒素B_1的等离子体降解产物的急性毒性研究[J]. 食品科技，2016，（1）：325-330.

[10] 张中义，秦 芸. 6种枝孢菌病害研究[J]. 西南农业大学学报，1997，（4）：315-319.

（责任编辑：成平）

Effects of Different Ventilation Conditions on Filamentous Fungi Type in Soil

XIA Yu
（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Took the paddy soil as material， treated with different ventilation conditions and 11 strains were screened by dilution coating plate method; cloning and sequence (ITS sequence) of these strains were amplified， sequenced and analyzed， and phylogenetic tree was established to identify the species of these strains. The results showed that the 11 strains were divided into fungi and actinomycetes， and filamentous fungi were divided into two groups: Aspergillus and Cladosporium， among them， the genetic relationship of the genus and Aspergillus was the closest. From the results of treatment effects of filamentous fungi type in the soil， the most beneficial ventilation method for rice was twice during the day， transplanting and tillering stage bubbled into 0.3 ‰ of H2O2.

filamentous fungi; paddy soil; IST sequence analysis; phylogenetic tree

S154.38

A

1006-060X（2016）10-0052-04

2016-06-29

夏 宇（1981-），男，湖南湘阴县人，硕士研究生，研究方向：生物工程。