林蛙头多糖的提取工艺优化及其降血脂功能1)

姜丽冬 田海娟 代伟长 金鑫 朴春红 王玉华 刘俊梅 胡耀辉 于寒松

(吉林农业大学，长春，130118)



林蛙头多糖的提取工艺优化及其降血脂功能1)

姜丽冬 田海娟 代伟长 金鑫 朴春红 王玉华 刘俊梅 胡耀辉 于寒松

(吉林农业大学，长春，130118)

采用生物酶法提取林蛙头多糖，应用响应面法对提取工艺进行了优化，分析了提取物对大鼠降血脂的功效。结果表明：林蛙头多糖最佳提取工艺参数为：酶解温度55 ℃、加酶量2%、林蛙头水溶液质量浓度1∶10 g/mL、酶解时间4.5 h、pH=10.0，此条件下林蛙头多糖得率最高为4.3%；高脂模型大鼠降血脂试验结果显示，林蛙头多糖能明显降低高脂模型大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)质量浓度，提高血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)质量浓度，对高脂大鼠具有显著的降血脂作用。

林蛙；林蛙头多糖；提取工艺；血脂

We extracted the polysaccharides ofRanachensinensishead by ultrasonic assisted enzymatic hydrolysis, optimized the extracting technique with response surface method, and studied the hypolipidemic effects of polysaccharides on rat serum lipids. The optimum technological conditions were the temperature of 55 ℃, 2% of enzyme concentration, solid-liquid ratio of 1∶10, hydrolysis time of 4.5 h, pH of 10.0, and the polysaccharides ofR.chensinensishead yield of 4.3%. The results of hyperlipidemia rats indicated that polysaccharides ofR.chensinensishead could significantly lower the concentration of TC, TG and LDL-C, but significantly improve the concentration of HDL-C, and the crude extract of polysaccharides could significantly lower blood lipid of hyperlipidemia rats.

中国林蛙是栖息于长白山深林中珍贵的两栖类野生经济动物，经传统中医论证和现代营养学研究证实，食用林蛙具有镇咳祛痰、抗疲劳、增强机体免疫功能、抗脂质过氧化等作用[1-2]。中国林蛙的常规食用部位包括林蛙卵、林蛙油、林蛙肉、林蛙皮等，目前多以林蛙油为研究和开发对象，而以林蛙头和林蛙骨肉等副产物为原料的开发利用相对较少[3-9]。不但导致对被摘除蛙油的雌性林蛙利用率低，而且导致雄性林蛙加工数量与雌性比相对很少；造成资源的极大浪费，导致林蛙生态失衡。

多糖(Polysaccharide)又称多聚糖，具有多种生物功能，如抗炎、抗肿瘤、降血脂等[10-15]，其中大部分多糖存在于植物和微生物中，而动物中一般含量较少，已经发现的动物多糖都具有特殊功能，黄林清等[16]通过对蚕蛹多糖的研究发现，蚕蛹多糖具有增强B、T淋巴细胞的增殖作用，增强小鼠的免疫功能。孙楠楠等[17]研究发现，乌贼墨汁多糖具有清除DPPH自由基和羟基自由基的作用，且具有较强的Fe3+还原能力，说明其具有抗氧化能力。姚晓燕等[18]研究表明，质量分数为27 mg/kg的黄鳝骨硫酸软骨多糖可以抑制小鼠甘油三酯(TG)质量浓度的升高，并能降低高脂小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和总胆固醇(TC)质量浓度。

林蛙多糖的提取有高压脉冲电场提取、碱法提取、酶法提取等，前者由于成本高很难用于工业化生产；后两者提取成本相对较低，有较好的产业化前景。林蛙多糖的提取，多集中于林蛙皮和整只林蛙，对林蛙头多糖的提取报道较少。本研究采用酶法提取林蛙头多糖，以期获得多糖的高提取率，并进一步对多糖粗提物的降脂功效进行研究，旨在提高林蛙的综合利用率，为林蛙资源高效利用提供参考。

1 材料与方法

冰鲜林蛙头，吉林省长白山生态食品有限公司提供；体内无特定的微生物和寄生虫存在的大鼠(SPF)级SD大鼠，体质量(200±20)g，雄性，60只，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供[实验动物生产许可证号：SCXK(吉)2013-0001]；碱性蛋白酶(2.4 L FG)，丹麦诺维信公司；TC试剂盒、TG试剂盒、HDL-C试剂盒、LDL-C试剂盒，均购自上海科华生物工程股份有限公司。

仪器设备：infinitieM200酶标仪，NanoQuant；FE20K pH计，瑞士梅特勒；Z36HK型高速离心机，德国HERMLE公司；PE52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；狮鼎牌循环水真空泵，郑州长城科工贸有限公司；FD-1B50型冷冻干燥机，北京博医康仪器有限公司；UV-1700型分光光度计，日本岛津。

林蛙头多糖的提取工艺：林蛙头于60 ℃低温烘干至恒质量后粉碎，加3倍体积石油醚，50 ℃索氏抽提脱脂12 h后，40 ℃烘干备用。以脱脂后的林蛙干燥粉为原料酶法提取多糖；提取后95 ℃灭酶10 min，抽滤、减压浓缩，加入5倍体积95%乙醇溶液沉淀、离心；按一定体积比加入Sevag试剂反复脱蛋白6次，直至溶液中无变性蛋白层；将上清液减压浓缩，加入3倍体积95%乙醇沉淀12 h，用蒸馏水溶解，装入分子截流量为8 000～14 000的透析袋中透析24 h，冷冻干燥后制得粗多糖。

林蛙头多糖提取单因素试验：按照酶生产厂家提供的最适作用温度55 ℃为酶水解温度，通过单因素试验研究了林蛙头水溶液质量浓度、酶解时间、加酶量、pH对林蛙头多糖提取率的影响。①选择林蛙头水溶液质量浓度分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL，加酶量2%(酶和底物的质量比)、酶解时间4 h、pH=10.0；②按照林蛙头水溶液质量浓度为1∶10 g/mL制备林蛙头水溶液，加酶量分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，其他条件同①；③加酶量2%，酶解时间分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，其他条件同②；④酶解时间4.5 h，pH为8.5、9.0、9.5、10.0、10.5，其他条件同③。按照4种方案分别研究不同条件对林蛙头多糖得率的影响。

林蛙头多糖提取响应面试验：在单因素试验基础上，选取料液比、酶解时间、加酶量、pH值4个因素，以林蛙头多糖提取率为指标进行响应面试验(见表1)，优化多糖提取工艺，通过Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归分析。

表1 提取林蛙头多糖Box-Behnken试验因素与水平

釆用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准品，测定粗多糖样品中的总蛋白质质量分数[19]。

数码是基于一个由无限重复的抽象物构建的体系，在那里，原件和它的副本没有区别：模拟物则衰老与腐朽，经历时代而逐渐消失，变幻着它的声音、它的面貌、它的气味。在模拟的世界里，一张照片的翻拍照片总意味时代迁移，变得失真，有所不同；一张数码照片的数码照片则无从分辨，于是“原作”失去了意义。[1]4

采用苯酚-硫酸法测定多糖质量分数，以葡萄糖为标准品制作标准曲线。取适量分析纯葡萄糖置于鼓风干燥箱中80 ℃干燥至恒质量，冷却后准确称取100 mg葡萄糖于500 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。反应体系各溶液体积按表2添加，先将标准葡萄糖溶液加入到具塞刻度试管中，再加入6%(按体积计)的苯酚溶液，最后加入10 mL浓硫酸混匀静置，待其冷却后于490 nm处测定吸光度，每组3个平行。以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度(490 nm时)为纵坐标绘制标准曲线。得线性回归方程为：y=0.855 5x+0.064 5，R2=0.995。同法测得林蛙多糖水溶液于波长490 nm处的吸光度，通过回归方程计算样品中多糖的质量分数，提取率=(提取的多糖质量/林蛙头粉中多糖质量)×100%。

表2 苯酚-硫酸法标准曲线绘制

高脂饲料中各组分质量百分比为：基础饲料78.8%、猪油10.0%、蛋黄10.0%、胆固醇1.0%、胆盐0.2%，混合均匀后制成颗粒并置于通风干燥处待用。大鼠自由摄食高脂饲料，连续喂养30 d。实验前大鼠自由摄食饮水，适应性饲养1周后，随机分为6组，每组10只。①正常对照组，饲喂普通饲料，灌胃生理盐水；②高脂模型对照组，饲喂高脂饲料，灌胃生理盐水；③阳性对照组，饲喂高脂饲料，灌胃洛伐他汀2 mg·kg-1·d-1；④林蛙头多糖低剂量组，饲喂高脂饲料，灌胃林蛙多糖200 mg·kg-1·d-1；⑤林蛙头多糖中剂量组，饲喂高脂饲料，灌胃林蛙多糖400 mg·kg-1·d-1；⑥林蛙头多糖高剂量组，饲喂高脂饲料，灌胃林蛙多糖600 mg·kg-1·d-1。喂养条件为每天光照时间12 h、温度控制在(20±2)℃、湿度(50±5)%。每周称量大鼠体质量1次。30 d后处死大鼠，取血37 ℃放置1 h、4 ℃放置2 h，再于4 ℃、3 000 r/min离心10 min，制备血清，-20 ℃保存。按照试剂盒说明书要求，测定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的质量浓度。

实验结果采用SPSS17.0统计软件分析，用单因素方差分析组间差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 林蛙头多糖提取工艺条件单因素试验

试验结果表明：①不同质量浓度林蛙头水溶液对林蛙头多糖得率的影响较大。质量浓度为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL时，林蛙头多糖得率分别为2.80%、2.60%、2.50%、2.40%、2.45%。当质量浓度为1∶10 g/mL时，林蛙头多糖得率最，本实验质量浓度选择1∶10 g/mL。②随着加酶量的增多，林蛙头多糖得率呈增加趋势。加酶量为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%时，多糖提取率分别为2.60%、2.70%、2.90%、2.92%、2.92%，当加酶量为2%时，多糖提取率达到2.9%，继续增加酶量，多糖得率增加不明显，因此本实验选择适宜加酶量为2.0%。③随着酶解时间的延长，多糖提取率呈显著增加趋势。酶解时间为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h时，多糖提取率分别为2.35%、2.50%、2.85%、2.96%、2.90%。当酶解时间达到4.5 h时，多糖提取率达到最大，因此选择最适酶解时间为4.5 h。④随着pH的升高，蛙头多糖得率也随之增大。pH为8.5、9.0、9.5、10.0、10.5时，多糖提取率分别为2.64%、2.70%、2.81%、2.98%、2.91%。当pH为10.0时多糖提取率最大，因此适宜pH选择10.0。

2.2 响应面法优化林蛙头多糖提取工艺条件

对表3试验结果进行统计学分析，4个因子经过拟合得到的二次回归方程为：Y=4.38+0.37A-0.017B-0.16C-0.050D-0.43AB-0.55AC-0.55AD+0.48BC+0.25BD+0.65CD-0.81A2-0.023B2+0.014C2-0.77D2。

根据Design Expert8.0.6软件分析可得响应面的3D图和等高线图(见图1)。经分析可知，提取林蛙头多糖的最佳条件是：在酶解温度为55 ℃的条件下，林蛙头水溶质量液浓度为1∶13 g/mL、酶解时间为4.4 h、加酶量1.95%、pH为10.0，此时林蛙头多糖提取率为4.3%。为验证模型的准确性，在最佳提取工艺条件下多糖提取率为4.42%，与预测值相近，表明响应面法所得的模型准确可靠。

2.3 林蛙头多糖对大鼠体质量的影响

由表5可见：各剂量组分别与空白对照组、模型对照组、药物阳性对照组比较，大鼠体质量随着饲喂时间的延长，均呈现上升趋势，其中阳性对照组、低剂量组、中剂量组体质量上升趋势低于模型对照组，但以上3组大鼠在饲喂过程中皮毛光滑、生理状态未出现异常，表明林蛙头多糖对大鼠没有毒副作用。

表3 提取林蛙头多糖Box-Behnken试验设计与结果

表4 提取林蛙头多糖响应面模型方差分析

注：*表示差异显著(P<0.05)；** 表示差异极显著(P<0.01)。

2.4 林蛙头多糖对大鼠血清脂质质量浓度的影响

由表6可见：4种血清指标中，模型对照组均与空白对照组具有极显著差异(P<0.01)，说明高脂模型建模成功。阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组与模型组相比，可降低高脂血症大鼠的TC、TG指标，其中阳性对照组、低剂量组与模型对照组在TC、TG两个指标中差异极显著(P<0.01)，TC指标中，低剂量组和中剂量组与模型对照组具有极显著差异(P<0.01)；HDL-C和LDL-C指标中，阳性对照组和各剂量组均有不同程度的升高，其中HDL-C指标中，中剂量组与模型对照组具有显著差异(P<0.05)，高剂量组与模型对照组具有极显著差异(P<0.01)；在LDL-C指标中，阳性对照组、低剂量组、高剂量组对模型组具有极显著关系(P<0.01)。由此可知，林蛙头多糖粗提物，可通过降低大鼠血清中TC、TG和LDL-C的质量浓度以及升高HDL-C质量浓度发挥其调节血脂的功效。

(1)为林蛙头水溶液质量浓度与酶解时间的响应面和等高线图；(2)为林蛙头水溶液质量浓度与加酶量的响应面和等高线图；(3)为林蛙头水溶液质量浓度与pH的响应面和等高线图。

图1 响应面法优化林蛙头多糖提取工艺的响应面和等高线图

注：表中数据为“平均值±标准差”，n=10。

表6 林蛙头多糖对血清脂质质量浓度的影响

g·L-1

注：表中数据为“平均值±标准差”。与空白对照组比较，▲▲ 表示P<0.01；与模型对照组比较，** 表示P<0.01、*表示P<0.05。

3 结论

本文以取油后的林蛙头为原料，采用碱性蛋白酶水解法对其多糖的提取工艺条件进行优化，并通过体内实验研究林蛙头多糖对高脂模型大鼠的降血脂作用。结果表明：林蛙头多糖的最佳提取工艺为：酶解温度55 ℃、加酶量2%、林蛙头水溶液质量浓度1∶10 g/mL、酶解时间4.4 h、pH值9.5，此时林蛙头多糖的提取率最高为4.3%；林蛙头多糖能显著降低高脂模型大鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)质量浓度，提高血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的质量浓度，表明林蛙头多糖具有良好的调节血脂功效。

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Optimizing Extraction and Hypolipidemic Effects of Polysaccharides from the Heads ofRanachensinensis//

Jiang Lidong, Tian Haijuan, Dai Weichang, Jin Xin, Piao Chunhong, Wang Yuhua, Liu Junmei, Hu Yaohui, Yu Hansong

(Jilin Agricultural University, Changchun 130118, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(10)：107-111.

Ranachensinensis; Polysaccharides ofRanachensinensishead; Extraction technology; Serum lipid

1)国家科技支撑计划项目(2013BAD16B09)；吉林省重大攻关项目(20140203021NY)。

姜丽冬，女，1988年5月生，吉林农业大学食品科学与工程学院，博士研究生。E-mail：529116685@qq.com。

胡耀辉，吉林农业大学食品科学与工程学院，教授。E-mail：huyaohui@vip.163.com。

于寒松，吉林农业大学食品科学与工程学院，教授。E-mail：yuhansong@163.com。

2016年6月13日。

S718.62；S852.5

责任编辑：张 玉。