基于NIR-SERS技术结合PCA-LDA统计分析肝癌术后恢复状况

熊 洋， 张德清， 高 飞， 司民真*

(1. 楚雄师范学院 光谱技术应用研究所， 云南 楚雄 675000; 2. 遵义医学院 基础医学院， 贵州 遵义 563003)



基于NIR-SERS技术结合PCA-LDA统计分析肝癌术后恢复状况

熊 洋1， 张德清1， 高 飞2， 司民真1*

(1. 楚雄师范学院 光谱技术应用研究所， 云南 楚雄 675000; 2. 遵义医学院 基础医学院， 贵州 遵义 563003)

采用近红外表面增强拉曼散射(NIR-SERS)光谱技术，基于高效、稳定、低廉的纳米银膜基底检测了25例肝癌患者、25例肝癌术后患者和25例健康人的氧合血红蛋白(OxyHb)。对比发现，健康人、肝癌术后患者和肝癌患者的OxyHb 的NIR-SERS光谱谱峰强度呈现依次下降的趋势，表明从谱峰强度可以初步判断肝癌术后患者恢复情况。利用主成分分析(PCA)结合线性判别分析(LDA)统计方法进行分析，25个肝癌术后患者中8人判别为健康人，其余17人判别为肝癌患者。判别分组与实际情况相符，表明PCA-LDA统计方法可以更准确地判断肝癌术后患者恢复状况。因此，NIR-SERS技术结合PCA-LDA统计方法有望为肝癌术后患者恢复状况的诊断提供一种新的思路和方法。

光谱学； 近红外表面增强拉曼散射； 肝癌术后； 氧合血红蛋白； 统计分析

1 引 言

拉曼光谱技术是一种重要的分子识别技术，很够提供分子结构的指纹信息，具有水干扰小、快速、无损、实时检测等优点[1,2]，被广泛应用于物理、化学、生物、医学等领域[3-7]。然而，由于分子的拉曼散射界面非常小，拉曼光谱灵敏度低，而且对于生物大分子来说，一般都具有较强的自体荧光发射，所以很难获得理想的光谱信号[1,8]。而为了获得较强的光谱信号一般采用提高激光功率和延长积分时间等方法，但这样会灼伤生物大分子，且产生很强的荧光背景[9]。这些缺陷很大程度上制约了拉曼光谱的应用。自1974年Fleischmann等[10]在粗糙的银电极上获得吡啶分子表面增强拉曼散射(SERS)光谱以来，SERS技术已经发展成为一种重要的检测手段。与拉曼光谱技术相比，SERS技术具有灵敏度高、可猝灭荧光等特点，目前被广泛应用于生物大分子的结构检测[8,11-13]。SERS光谱检测中经常使用纳米银胶作为SERS基底，银胶虽然具有制作简单、使用方便等特点，但一般很难制备出粒径分布集中、具有固定大小的银粒子，而且稳定性较差[14-15]。我们在实验中使用电解法制备的高效、稳定、低廉且粒径分布集中的纳米银膜作为SERS检测基底，使用近红外(NIR)激发光源，这样可以更有效地降低生物分子的荧光效应，同时可以使用功率较小的激发光来避免生物大分子“光致损伤”。

肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤。在常见恶性肿瘤中，肝癌导致病人死亡率在全球排第四，在我国排第二，100 000人中就有55人为肝癌患者[16]。近年来，利用SERS技术诊断癌症已成为一个重要的研究方向，国外许多课题组[17-19]以及国内陈荣教授、唐伟跃教授、刘仁明副教授[20-22]等课题组对宫颈癌、胃癌、肝癌等患者组织、细胞、血液等进行了SERS检测，分析了癌症患者与健康人的区别，并利用统计分析方法对癌症进行诊断，为SERS技术诊断癌症提供了新的思路和方法。然而，利用SERS技术来诊断癌症患者术后恢复状况却未见类似的报道，且更重要的是癌症术后患者的恢复情况是反映治疗效果以及患者身体健康状况的一项重要指标，对降低癌症患者死亡率以及延长寿命具有重要的意义。前期工作表明，利用SERS技术可以较准确地区分健康人和癌症患者的氧合血红蛋白(OxyHb)，PCA-LDA统计方法可以较好地诊断肝癌。本实验是前期肝癌诊断工作[22]的延续，利用NIR-SERS技术检测肝癌、肝癌术后患者和健康人的OxyHb，通过分析光谱图，同时结合PCA-LDA统计方法来判断肝癌术后患者恢复情况，为诊断肝癌术后患者的恢复状况提供了一种新的思路和方法。

2 实 验

2.1 样品采集与提取

样品采集：健康人、肝癌患者、肝癌术后患者新鲜血液样品各25例，每例3 mL，均采集于遵义医学院附属医院，采集时间为上午7点到8点之间。

OxyHb的提取：采用课题组前期OxyHb的提取方法[22]，离心机为上海安亭科学仪器厂小型台式离心机TGL-16G。

2.2 基底制备和光谱采集

基底制备：采用课题组前期静电自组装技术制备的纳米银膜[22]。前期实验表明，该纳米银膜稳定、低廉、重复性好，对OxyHb有明显的增强效果[21-22]。制备好的纳米银膜使用荷兰飞利浦公司电子扫描显微镜S-505进行表征。

光谱采集：将提取好的样品每例50 μL滴到制备好的纳米银膜上，形成直径约为1 cm的均匀液体膜。干燥后，使用美国海洋光学公司便携式拉曼光谱仪R-3000TM进行检测，激发光波长为785 nm，激光光斑半径为45 μm，激光功率密度J=103W·cm-2，积分时间为16 s。

3 结果与讨论

3.1 OxyHb NIR-SERS光谱

图1为纳米银膜的扫描电镜(SEM)图及其紫外-可见吸收光谱。图中银粒子的尺寸主要分布在200 nm附近，粒径较集中，相邻的银粒子间形成200 nm大小的“热点”。“热点”内的电磁场可获得巨大增强，增强因子可达1012～1014倍[23]。当OxyHb分子有效地嵌入“热点”中时，用激发光照射可以获得高强度的SERS光谱。图中纳米银膜的等离子体共振带位于400～900 nm，延长到近红外区，与拉曼检测激发光波长785 nm有较好的匹配，这样可以更有效地引起共振增强拉曼效应，降低荧光效应[21]，获得理想的NIR-SERS光谱。

Fig.1 SEM image and UV-Vis absorption spectrum of Ag nanofilm

图2中谱线a、b、c分别为OxyHb的常规拉曼光谱、OxyHb在银胶中的SERS光谱和在纳米银膜上的NIR-SERS光谱。从图中可以看出，使用银胶作为SERS基底，光谱信号虽然有所增强，但还是很微弱，而实验制备的纳米银膜对OxyHb的拉曼散射增强效果更为显著。图3中a、b、c分别为25个肝癌患者、25个肝癌术后患者和25个健康人的OxyHb 的NIR-SERS光谱。对比发现，健康人、肝癌术后患者和肝癌患者的OxyHb 的NIR-SERS光谱形状基本相似，但光谱强度呈现依次下降的趋势，而在812，1 208，1 582 cm-1处的谱峰这种现象更为明显。造成这种情况的原因是患者体内肿瘤细胞异常生长、增殖，需要大量的养料，其上皮粘膜组织微血管不断增生而使微血管中氧的含量明显减少，导致肿瘤组织、血液中去氧血红蛋白的增加，而其体内紊乱的新陈代谢使得肿瘤组织、血液中OxyHb的浓度明显降低[24]。由于肝癌术后患者进行了一定的治疗，身体健康状况得到了一定的改善，所以其血液中OxyHb的浓度相对肝癌患者一般要大，相对健康人要小。而光谱强度与样品浓度有一定的关系，从而表现出肝癌术后患者的OxyHb的NIR-SERS光谱谱峰强度比健康人小，比肝癌患者要大。

图2 健康人OxyHb的常规拉曼光谱(a)、在银胶中的SERS光谱(b)和在纳米银膜上的NIR-SERS光谱(c)。

Fig.2 Normal Raman spectra of OxyHb (a)， SERS spectra of OxyHb adsorbed on colloidal Ag nanoparticles(b) and NIR-SERS spectra of OxyHb adsorbed on Ag nanofilm, respectively.

图3 25个肝癌患者(a)、25个肝癌术后患者(b)和25个健康人(c)的OxyHb的 NIR-SERS光谱。

Fig.3 NIR-SERS spectra of OxyHb of 25 liver cancer patients (a)， 25 liver cancer patients after surgery (b) and 25 healthy persons (c), respectively.

为了便于从光谱形状和谱峰强度初步来判断肝癌术后患者恢复情况，图4作出了肝癌患者a、肝癌术后患者b、c和健康人d的 OxyHb具有代表性的NIR-SERS光谱图。从图中看出，肝癌术后患者b与健康人d的OxyHb的NIR-SERS光谱形状和谱峰强度相比区别较小，而术后患者c却与患者a相似。因此可以初步判断，肝癌术后患者b在手术后恢复效果可能较好，氧合血红蛋白浓度等已经和健康人相似，身体健康状况已接近健康人，而术后患者c的身体状况仍没有明显的改善。

图4 肝癌患者(a)、肝癌术后患者(b、c)和健康人(d)的 OxyHb具有代表性的NIR-SERS光谱图。

Fig.4 Typical NIR-SERS spectra of OxyHb of liver cancer (a), liver cancer patients after surgery (b, c) and healthy person (d), respectively.

3.2 OxyHb NIR-SERS光谱的统计分析

为了更准确地判断肝癌术后患者术后恢复状况，下面将使用PCA-LDA统计方法。PCA统计方法可以从多个变量中提取较少变量来反应数据的主要信息；LDA统计分析方法可以对癌症进行诊断，得到诊断的特异性与灵敏度，而且可以对未知组进行判别。所有光谱扣除荧光背景，对拉曼位移位于472，663，772，812，1 125，1 208，1 336，1 423，1 582 cm-1处的谱峰面积归一化处理。面积归一化就是将所有谱峰面积相加得到总面积，然后用每个谱峰面积除以总面积及得到归一化面积，该方法可以避免样品浓度、实验条件微小差异所带来的影响[8]。然后，使用SPSS19.0进行统计分析。

利用PCA分析得到具有显著差异的PCA得分(PCs)分别为PC2、PC4和PC7(p<0.05)。图5为25个健康人、25个肝癌患者和25个术后患者的OxyHb的NIR-SERS光谱的PCA得分散点图。可以看出，肝癌患者大都分布在图形下方，健康人主要分布在图形上方，这与前期肝癌诊断结果相似，而肝癌术后患者大部分分布在肝癌患者所在区域。因此可依据肝癌术后患者分布的区域来初步判断肝癌患者术后恢复状况。若分布在健康人所在区域，说明术后恢复可能比较理想；而分布在癌症患者区域，则说明手术治疗效果相对较差，恢复情况较差。

图6为25个健康人、25个肝癌和25个术后患者PCA得分利用LDA方法得到的判别式得分二维散点图。以图中虚线YDSF2=-2.5XDSF1-0.5为分割线，肝癌患者和健康人分别分布在虚线的左方和右方，利用该虚线诊断肝癌得到特异性与灵敏度都为100%，总正确率为100%，故以此虚线对肝癌术后患者进行判别分析是可行的。以该虚线对肝癌术后患者进行判别分析，其中8人判别为健康人，其余17人判别为肝癌患者，这与图5中肝癌术后患者分布情况基本相符合。由此可以初步预测，这8人的术后恢复效果较好，而其余17人术后恢复较差。由于肝癌具有易转移和复发等特点，想要彻底清除肿瘤细胞非常困难，这导致大部分患者经过手术、化疗、放疗等一系列手术治疗后仍很难见到治疗效果[21,25]，由此可见对肝癌术后患者的判别分组是符合实际情况的。经后期肝癌术后患者在治疗过程中的调查统计，发现这8人术后恢复效果相对其余17人确实要好。故利用该虚线可以较准确地判断肝癌术后患者手术后的恢复状况。当然该判别方法可靠性还需要更加大量的调查和统计结果，这也是后续工作的一部分。因此该方法可能成为临床判断肝癌术后患者恢复状况的一种较可靠的方法。

图5 25个健康人、25个肝癌患者和25个术后患者的OxyHb的NIR-SERS光谱的PCA得分散点图。

Fig.5 3D scatter plot of PCA score of OxyHb NIR-SERS spectra of 25 healthy persons, 25 liver cancer patients and 25 liver cancer patients after surgery.

图6 25个健康人、25个肝癌和25个术后患者的PCA得分利用LDA方法得到的判别式得分二维散点图。

Fig.6 Combined-groups discriminant score plots of 25 healthy persons, 25 liver cancer patients and 25 liver cancer patients after surgery.

4 结 论

采用电解法制备了高效、稳定、低廉的纳米银膜，检测了25例健康人、25例肝癌和25例肝癌术后患者的OxyHb的NIR-SERS光谱，通过分析谱峰强度以及使用PCA-LDA统计方法研究了患者的肝癌术后恢复状况。分析发现，肝癌术后患者的OxyHb的NIR-SERS光谱谱峰强度比健康人小，比癌症患者大，因此依据光谱谱峰强度可初步判断肝癌术后患者恢复状况。采用PAC-LDA统计方法对肝癌术后患者恢复情况进行诊断，其中8人判别为健康人，其余17人判别为肝癌患者。判别分组与实际情况相符，表明该方法可以更准确地判断肝癌术后患者恢复情况。因此，NIR-SERS技术结合PCA-LDA统计方法有望为诊断肝癌术后患者恢复状况提供新的思路和方法。

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熊洋(1987-)，男，湖北广水人，硕士，助教，2013年于郑州大学获得硕士学位，主要从事生物医学光子学方面的研究。

E-mail: victor_xy2014@163.com司民真(1962-)，女，云南楚雄人，博士，教授，2010年于哈尔滨工业大学获得博士学位，主要从事分子光谱学应用的研究。

E-mail: siminzhen@hotmail.com

Recovery Situation of Liver Cancer After Surgery Using Near-infrared Surface-enhanced Raman Spectroscopy Combined with PCA-LDA Analysis

XIONG Yang1, ZHANG De-qing1, GAO Fei2, SI Min-zhen1*

(1.ApplicationInstituteofSpectroscopyTechnology,ChuxiongNormalUniversity,Chuxiong675000,China; 2.BasicMedicalSchool,ZunyiMedicalUniversity,Zunyi563003,China)

*CorrespondingAuthor,E-mail:siminzhen@hotmail.com

The near-infrared surface-enhanced Raman scattering (NIR-SERS) spectra with high efficiency, stable and low-cost silver nanofilm were used to detect the oxyhemoglobin (OxyHb) of 25 healthy persons, 25 liver cancer patients and 25 liver cancer patients after surgery. Compared the intensity of three group spectra, it was found that the intensity of Raman peaks decreased in sequence for healthy persons, liver cancer patients after surgery and liver cancer patients, indicating that this method could preliminary judge the recovery situation of liver cancer patient after surgery. Meanwhile, by using principal component analysis (PCA) combined with linear discriminant analysis(LDA), 25 liver cancer patients after surgery were divided into two groups, 8 healthy persons and 17 liver cancers. It accorded with the actual situation. Therefore, PCA-LDA can more accurate judge the recovery situation of liver cancer patients after surgery. The results demonstrate that OxyHb NIR-SERS spectroscopy may be a potentially clinically useful tool for the diagnosis of recovery situation of liver cancer patients after surgery.

spectroscopy; NIR-SERS; liver cancer after surgery; OxyHb; statistical analysis

1000-7032(2016)10-1275-06

2016-05-06；

2016-08-14

国家自然科学基金(13064001); 云南省应用基础研究计划青年项目(2013FD044，2016FD086)资助

O657.3

A

10.3788/fgxb20163710.1275