东北林蛙重组抗菌肽dybowskin-1ST部分理化特性和生物学活性研究

李 玉 刘 琦 王敬之 柴龙会 周 旋 肖向红

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

东北林蛙重组抗菌肽dybowskin-1ST部分理化特性和生物学活性研究

李 玉 刘 琦 王敬之 柴龙会 周 旋 肖向红*

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

东北林蛙；

目的：对具有广谱抑菌活性的东北林蛙(Ranadybowskii)重组抗菌肽dybowskin-1ST进行热稳定性、酸碱稳定性、局部过敏反应(Arthus反应)及溶血活性分析，为进一步摸清重组肽的理化特性及其应用提供科学依据。方法：将重组抗菌肽dybowskin-1ST分别置于不同环境温度(25～100℃)及不同酸碱环境(pH2～pH12)中处理4 h，观察其对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)及大肠杆菌(Escherichiacoli)的抑菌环直径，确定其稳定性；用不同浓度梯度的重组dybowskin-1ST进行溶血试验和局部过敏反应(Arthus反应)。结果：1.重组dybowskin-1ST在25～100℃温度及pH2～pH12环境下均有抑菌活性，其中，最适环境温度为25℃；重组dybowskin-1ST在pH3～pH7范围对Staphylococcusaureus抑菌活性较强(抑菌环直径为12.77～13.17 mm)，在pH3～pH8范围对Escherichiacoli抑菌性较强(抑菌环直径为12.63～13.37 mm)。2.溶血试验结果显示，重组dybowskin-1ST对家兔红细胞的溶血率在0.14%～4.4%；小鼠Arthus氏试验观察其腹部皮下重组dybowskin-1ST注射部位红肿不明显，无出血、坏死等炎性反应。结论：实验结果显示重组dybowskin-1ST具有较好稳定性、低溶血性及低致敏性，为其应用提供科学依据。

两栖类动物皮肤腺分泌物中富含功能多样、结构特殊的活性多肽。首先由Zasloff研究组在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的皮肤和胃粘膜上皮细胞发现抗菌肽(Maganins)[1]，随后来自南美蛙的Dermaseptin、来自南亚虎纹蛙的Tigernin-1以及欧洲林蛙的Temporin A等多肽相继被发现。抗菌肽作为两栖类机体防御的主要活性物质，是两栖动物机体固有免疫的重要组成部分之一[2-3]。两栖类抗菌肽可以抑制细菌、原生生物及病毒的生长[4-8]，可用作新型的抑菌抗病毒药。

本研究从东北林蛙(Ranadybowskii)皮肤分泌物筛选出一种新的抗菌肽dybowskin-1ST[9]，郭娜对其进行了体外重组表达并纯化，得到分子量为6.7 KD的抗菌肽，且具有广谱抑菌活性[10]。本试验以东北林蛙皮肤重组抗菌肽dybowskin-1ST为研究对象，通过测定其热稳定性、酸碱稳定性、局部过敏反应(Arthus反应)及溶血活性，为其进一步应用提供科学依据。

1 试验材料

东北林蛙重组皮肤抗菌肽dybowskin-1ST冻干粉(本实验室制备)、LB固体培养基、LB液体培养基、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、大肠杆菌(ATCC25922)菌悬液、PBS溶液、小鼠[合格证号SCXK-(吉)2011-004，体重为(20±2)]30只、兔血(百奥莱博)。

2 试验方法

2.1 热稳定性及活性的检测

2.1.1 将重组dybowskin-1ST冻干粉稀释成浓度为 100 μg/mL溶液，分别在25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃环境(电热恒温水浴箱 上海医疗器械厂)中处理4 h，进行实验。

2.1.2 分别将Staphylococcusaureus及Escherichiacoli悬液1 mL加入到含100 mL灭菌LB液体培养基的锥形瓶中，在气浴摇床(IKA KS4000ic控制型摇床)37℃、150 rpm条件中培养14 h，各取1.5 mL菌液与50 mL灭菌LB固体培养基混匀。

2.1.3 制备双层琼脂平板，下层加入8 mL LB固体培养基，待其凝固后分别加入步骤2的产物，再次凝固后用200 μL无菌枪头(直径0.6 cm)打孔，每孔各加入步骤1中处理后的浓度为 100 μg/mL重组dybowskin-1ST 50 μL，空白对照加入100 μL PBS溶液，在恒温培养箱(上海埃朗仪器有限公司)中37℃培养24 h观察结果。

2.2 酸碱稳定性

将重组dybowskin-1ST冻干粉分别用pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12的PBS溶液稀释成浓度为 100 μg/mL溶液，进行实验。

按2.1中试验步骤2及步骤3检测各组抑菌活性。

2.3 局部过敏反应

随机取成年小鼠30只，雌雄各半，随机分为5组(对照组、试验组1、试验组2、试验组3及PBS溶液组)，1～3试验组小鼠腹部皮下反复注射0.2 mL浓度为100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL的重组dybowskin-1ST，重复4次，当局部出现细胞浸润后，再次分别注射不同浓度的重组dybowskin-1ST。

分别观察注射后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h及8 h的小鼠局部的红肿情况。

2.4 溶血试验

制备红细胞悬液：取兔血于室温下3 000 r/min离心(JOUAN公司MR1022型高速台式冷冻离心机)10 min，收集底层红细胞，PBS洗涤3次至上层溶液澄清，用PBS将红细胞稀释为2%的细胞悬液，备用。

在1～10号离心管中依次加入浓度为100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL、1.56 μg/mL、0.78 μg/mL、0.39 μg/mL、0.195 μg/mL重组dybowskin-1ST 100 μL，11～12号离心管分别加入100 μL水(阳性对照)和PBS溶液(空白对照)。1～11号管分别加入2%兔红细胞悬液100 μL后充分混匀，37℃孵育1 h，于 1 200 r/min离心5 min。吸取上清液移至96孔板中，1～12号离心管分别对应96孔板中1～12孔，各设3个复孔。酶标仪(BioTek Synergy HT)测定540 nm下各孔光吸收值。溶血百分率依据以下公式计算：

2.5 数据分析

对所获得的实验数据利用SPSS软件进行方差分析对数据进行分析比较，P<0.05认为差异显著且有统计学意义。

3 结果

3.1 热稳定性及活性检测

重组dybowskin-1ST在25～100℃处理4 h后，肉眼观察无固体沉淀或胶状物，说明热稳定性良好。25～100℃处理4 h后，重组dybowskin-1ST对Escherichiacoli及Staphylococcusaureus的抑菌试验结果如图1所示，抑菌环直径及其统计学意义如图2所示，显示具有良好的抑菌活性。

如图1、2所示，数据均有显著性(P<0.05)，25～100℃处理后的重组dybowskin-1ST对Staphylococcusaureus均有抑制作用，其中25℃和70℃的抑菌活性较强，抑菌环直径分别为14.37 mm及14.43 mm；25～70℃处理后的重组dybowskin-1ST对Escherichiacoli均有抑制作用，其中25℃的抑菌活性最强，抑菌环直径为15.37 mm，但经80～100℃处理后其抑菌活性降低。

图1 不同温度下重组dybowskin-1ST的抑菌活性(A、B、C为Escherichia coli，D、E、F为Staphylococcus aureus)Fig.1 Antibacterial activity of recombinant antimicrobial peptides dybowskin-1ST under different temperatures

图2 不同温度下重组dybowskin-1ST的抑菌环直径(E为Escherichia coli，S为Staphylococcus aureus，组间对比变量有且只有温度)Fig.2 Recombinant antimicrobial peptides dybowskin-1ST zone diameters under different temperatures

3.2 酸碱稳定性试验

将重组dybowskin-1ST冻干粉分别用pH2～pH12的PBS稀释为100 μg/mL溶液，肉眼观察无固体沉淀或胶状物，说明酸碱稳定性良好。不同pH处理下重组dybowskin-1ST 对Escherichiacoli和Staphylococcusaureus均有抑制作用如图3所示，抑菌环直径及其统计学意义如图4所示。

如图3、4所示，数据均有显著性(P<0.05)，重组dybowskin-1ST在pH2～pH8条件下对Staphylococcusaureus均有抑菌活性(抑菌环直径为12.03～13.17 mm)，但在pH9～pH12下则抑菌活性不明显(抑菌环直径为11.0～11.7mm)；而重组dybowskin-1ST在pH2～pH12条件下对Escherichiacoli均有抑菌活性(抑菌环直径为12.03～13.57mm)。

图3 不同pH条件下重组dybowskin-1ST的抑菌活性(A、B、C为Escherichia coli，D、E、F为Staphylococcus aureus)Fig.3 Antibacterial activity of recombinant antimicrobial peptides dybowskin-1ST under different pH

图4 不同pH条件下重组dybowskin-1ST的抑菌环直径(E为Escherichia coli，S为Staphylococcus aureus，组间对比变量有且只有pH)Fig.4 Recombinant antimicrobial peptides dybowskin-1ST zone diameters under different pH

3.3 局部过敏反应(Arthus反应)

1～3试验组小鼠腹部皮下分别注射100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL重组dybowskin-1ST 0.2 mL，注射部位呈局限性条状肿胀，长径为2 cm。2 h后各试验组无明显炎性反应，肿胀长径为1.5 cm；4 h后各试验组肿胀长径为0.9 cm；6 h后各试验组肿胀完全消失；8 h后仍无红肿热胀。

3.4 溶血活性试验

如图5所示，数据均有显著性(P<0.05)，不同浓度的重组dybowskin-1ST对家兔红细胞的溶血率在0.14%～4.4%，其中，重组dybowskin-1ST为50 μg/mL时的溶血率最大，约为4.4%。

图5 不同浓度重组dybowskin-1ST的家兔红细胞溶血率Fig.5 Different concentrations of recombinant dybowskin-1ST rabbit red blood cell hemolysis rate

4 讨论

两栖类皮肤抗菌肽通常是由10～60个氨基酸构成的具有广谱抗细菌、真菌、病毒和肿瘤的活性[11-14]的小分子肽。苗慧敏、杨淑静发现在虹彩病毒胁迫下东北林蛙皮肤中抗菌肽Temperin-2ST、Ranatuerin-2Amb、Ranatuerin-2YJ、Temperin-YJa、Temperin-YJb等具有广谱抗菌活性[15-16]；申屠德君[8]在东北林蛙皮肤中发现了一种具有抗菌活性的新型抗菌肽dybowskin-1ST[8]；郭娜对其进行了体外重组表达纯化，获得分子量为6.7 KD的重组dybowskin-1ST，且具有广谱抑菌活性[10]。

影响蛋白质稳定性的主要原因包括：温度、pH、氧化作用、蛋白水解酶、变性剂等。重组dybowskin-1ST作为肽类物质，其热稳定性、酸碱稳定性和溶血活性等特性对于评估重组dybowskin-1ST是否具有潜在的应用前景具有重要意义。本试验依据《消毒技术规范》(2008年)及CLSI标准[17]判断抑菌活性(即抑菌环大于7 mm为有效)及敏感性，进行了不同温度、pH条件下重组dybowskin-1ST的抑菌试验。结果表明，重组dybowskin-1ST具有较好的热稳定性和酸碱稳定性，在25～100℃条件下重组dybowskin-1ST对Staphylococcusaureus和Escherichiacoli均有抑制作用(P<0.05)，但80～100℃处理后对Escherichiacoli的抑菌活性降低。在pH2～pH12条件下重组dybowskin-1ST对Escherichiacoli和Staphylococcusaureus均有抑制作用(P<0.05)，其中重组dybowskin-1ST在pH 9～pH12条件下对Staphylococcusaureus的抑菌活性降低。究其原因，可能是抗菌肽由氨基酸组成且具有一定的蛋白质二级结构[18-19]，在高温或强酸碱处理后使抗菌肽二级或三级结构被破坏(如二硫键、氢键、二级折叠等)，导致抗菌肽结构改变，抑菌活性降低。Arthus反应结果显示，重组dybowskin-1ST具有低致敏性，无明显炎性反应，且药物吸收较快。根据《药品标准》规定，供试药品在1 h内出现溶血反应或溶血率大于5%的则不宜体内注射，本试验中各浓度重组dybowskin-1ST溶血率(0.14%～4.4%且P<0.05)均低于5%。

本试验结果表明，重组dybowskin-1ST具有较好的热稳定性和酸碱稳定性，且溶血性和致敏性低，具有良好的应用前景。

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Ranadybowskii；Recombinant antibacterial peptide dybowskin-1ST；Thermal stability；Arthus reaction；Hemolytic activity

ThePhysicochemicalPropertiesandBiologicalActivityofRecombinantAntimicrobialPeptide-Dybowskin-1STinRanadybowskii

LiYuLiuQiWangJingzhiChaiLonghuiZhouXuanXiaoXianghong*

(NortheastForestryUniversity，Harbin，150040，China)

We analyzed the thermal stability，pH stability，local allergic reaction(Arthus reaction) and hemolytic activity of one antimicrobial peptide dybowskin-1ST in the frog Rana dybowskii which is characterized by broad-spectrum antibacterial activity． The physicochemical properties of its recombinant peptide were examined，thereby providing scientific basis for practical application． The recombinant antimicrobial peptide dybowskin-1ST was pretreated at different temperature( 25 - 100 ℃) and different pH environments( pH2-pH12) for 4 h． Then its stability was determined by observing the size of inhibition zone against Staphylococcus aureus and Escherichia coli． Hemolysis assay and Arthus reaction were performed with different concentrations of recombinant dybowskin -1ST． Result showed that recombinant dybowskin-1ST have antibacterial activity at ambient temperatures of 25-100℃ and pH2-pH12，wherein the optimum ambient temperature was 25℃． Recombinant dybowskin-1ST holds strong antibacterial activity against Staphylococcus aureus( inhibition zone diameter of 12. 77-13. 17 mm) at pH3-pH7. However，it holds strong antibacterial activity( inhibition zone diameter of 12. 63-13. 37 mm) against Escherichia coli at pH3- pH8. Hemolysis test showed that the hemolysis rate of the recombinant dybowskin-1ST on rabbit erythrocyte was 0. 14%-4. 4%． Arthus's test showed no bleeding，necrosis，inflammation at the abdominal injection site of mice with recombinant dybowskin-1ST． We conclude that recombinant dybowskin-1ST has good stability，low hemolytic and hypoallergenic properties，thereby providing scientific basis for practical application．

稿件运行过程

2016-01-15

修回日期：2016-02-01

发表日期：2016-05-10

抗菌肽dybowskin-1ST；

稳定性；

局部过敏反应；

溶血活性

S858.94

A

2310-1490(2016)02-129-05

东北林业大学大学生创新性实验计划项目(No.111025065)；国家级大学生创新训练项目(No.111022519)；国家级实验教学示范中心建设专项；国家自然科学基金项目(30870301)；黑龙江省自然科学基金重点项目(ZJN0604-02)

李玉，女，24岁，硕士研究生；主要从事分子生物学实验研究。

*通讯作者：肖向红，E-mail：xiaoxh2010@sina.com