刺五加栽培基质对黑木耳多糖化学组成及抗氧化性的影响*

张颖，曾艳，邱广君，李星硕，孙媛霞**

（1.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津300308；2.黑龙江国誉生物科技发展股份有限公司，黑龙江鸡东158200）

〈生理生化〉

刺五加栽培基质对黑木耳多糖化学组成及抗氧化性的影响*

张颖1，曾艳1，邱广君2，李星硕1，孙媛霞1**

（1.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津300308；2.黑龙江国誉生物科技发展股份有限公司，黑龙江鸡东158200）

为探讨刺五加栽培基质对黑木耳及其多糖化学组成、抗氧化性的影响。以刺五加基质栽培的黑木耳为原料，以非刺五加栽培的黑木耳为对照，测试了2种黑木耳总糖、总蛋白、脂肪、总酚和灰分的含量；通过纤维素酶酶解、NaOH提取和水洗连续提取黑木耳多糖，并对提取物的化学组成与抗氧化性进行了分析。结果表明，2种黑木耳的总糖含量均超过55%，其多糖均由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和岩藻糖组成。然而，与对照相比，刺五加黑木耳的多酚含量明显提高，含有蛋白质7.9%，单糖组成中的葡萄糖含量明显降低，半乳糖含量明显增加。其中，含蛋白的刺五加黑木耳多糖中半乳糖的摩尔百分含量为32.4%，是对照的4.8倍，其氧自由基和ABTS自由基清除能力也分别提高了3.2倍和2.7倍。刺五加栽培基质的使用，能改变黑木耳化学成分的合成代谢途径，对黑木耳活性成分的产量与功能提升具有重要作用。

刺五加基质；黑木耳；多糖；单糖组成；抗氧化性

黑木耳（Auricularia auricula）属于真菌门（Eumycota）担子菌亚门（Basidiomycotina）木耳目（Auriculariales）木耳科（Auriculariaceae）木耳属（Auricularia）真菌，生长于木质基质上。其起源于我国，距今已有14 000年的历史，在我国食用菌产业体系中占有重要地位［1］。作为公认的高营养保健食品，黑木耳被报道的众多功效如促进血液循环、润肺、降血糖、止血、消炎、抑制溃疡和吸附作用等［2］与其多糖成分密切相关［3］。而真菌多糖的生物活性又与其来源、理化性质、单糖组成、结构和分支度，甚至提取、分离手段等密切相关［4］。传统中药材刺五加（Eleutherococcus senticosus）具有调节机体紊乱、益气健脾、补血安神、抗疲劳、改善体内循环系统等功能［5］。黑龙江省的农技人员，利用刺五加的生长地域优势，开展了刺五加或刺五加渣栽培黑木耳的技术研究［6-7］，发现刺五加栽培的黑木耳肉质厚、味甘平、口感好。然而，目前未见刺五加栽培基质对黑木耳和其多糖化学组分与功能影响的相关报道。本研究对刺五加、非刺五加基质栽培黑木耳的主要化学成分进行比较分析，在此基础上提取黑木耳多糖提取物，对多糖提取物的组成和抗氧化性进行分析比较，以期为刺五加栽培黑木耳的营养功能改善提供理论依据，促进刺五加栽培黑木耳及其下游相关产品的研究开发。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

同一菌种，刺五加与普通基质栽培的黑木耳均由黑龙江国誉生物科技发展股份有限公司提供。其中普通基质栽培的黑木耳作为对照。

2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐［2，2'-Azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH］、牛血清蛋白BSA、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖购自美国Sigma-Aldirch公司；肌醇、半乳糖醛酸、间羟基联苯（3-phenylphenol）购自北京索莱宝科技有限公司公司。纤维素酶（Cellulase）ACCF-4740购自日本明治制果药业株式会社。

1.2仪器与设备

UV-1800紫外分光光度计，日本岛津公司；Spectra Max M5多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；Sorvall Evolution RC高速落地离心机，美国Thermo Scientific公司；IKA RV10旋转蒸发仪，德国IKA集团；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，河南省予华仪器有限公司；FD-1-50真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；Agilent 1200 Series高效液相色谱、Agilent 5975C GC/7200 Q-TOF精确质量四级杆飞行时间质谱，美国安捷伦公司。

1.3方法

1.3.1黑木耳子实体中主要化学成分测试方法

蛋白质：参照GB 5009.5-2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定第一法；总糖（以葡萄糖计，干基）：参照GB/T 15672-2009食用菌中总糖含量的测定；脂肪：参照GB/T 5009.6-2003食品中脂肪的测定第二法；灰分：参照GB 5009.4-2010食品安全国家标准食品中灰分的测定；总酚：福林酚法，参考Kim等［8］方法，以没食子酸为标准品。

1.3.2黑木耳子实体多糖的提取

参考王金凤［9］、Sone等［10］的方法。具体提取工艺见图1。

图1　黑木耳多糖提取步骤Fig.1Fractional preparation of polysaccharides from Auricularia auricula

取干燥、粉碎后的黑木耳以1∶40（m·V-1）的料液比加入二次水，调节pH为4.0，加入样品质量1%的纤维素酶Cellulase ACCF-4740，在45℃酶解2 h，95℃灭酶15 min，离心取上清液；在残渣中加入二次水在120℃下高压处理20 min后，离心；其上清液与酶解上清液合并，减压浓缩后加入4倍体积的无水乙醇沉淀，冻干后得到酶解多糖。剩余残渣用浓度为1 mol·L-1NaOH在60℃下继续提取2 h，提取结束后用盐酸中和，离心，上清液透析后，减压浓缩，再加入4倍体积的无水乙醇沉淀，冻干后得到碱提多糖；剩余残渣用二次水彻底清洗，透析后，减压浓缩，再加入4倍体积的无水乙醇沉淀，冻干后得到水提多糖。

1.3.3黑木耳子实体多糖理化指标测试

采用硫酸苯酚法，以葡萄糖为标准品，测试糖质量分数［11］；采用Bradford法，以牛血清蛋白（BSA）为标准品，测试蛋白质量分数［12］；采用间羟基联苯法，以半乳糖醛酸为标准品，测试糖醛酸质量分数［13］。

1.3.4黑木耳子实体多糖的单糖组成分析

各取2 mg不同组分多糖样品，分别加1 mL的2 mol·L-1三氟乙酸（TFA），密封，110℃，水解2 h，冷却后通N2吹干，再用硼氢化钠NaBH4还原，经乙酰化处理后，氯仿萃取3次，用水反洗4次～5次，无水硫酸钠（Na2SO4）脱水，进行GC-MS/GC上机分析。

气相色谱条件：安捷伦5975C气相色谱仪，色谱柱为HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），进样口温度250℃，载气为高纯He，流速为16.2 mL·min-1，柱温度170℃下保持0 min，1℃·min-1至190℃保持0 min，2℃·min-1至240℃保持5 min。进样量1 μL，分流比10∶1。

质谱条件：用电子轰击（electron impact EI）源分析，电子能量为70 eV，离子源温度200℃，接口温度280℃。选取全程离子碎片扫描（full scan）模式时，质量扫描范围为45～550，溶剂延迟4.0 min。

1.3.5黑木耳子实体多糖清除氧自由基测试方法

采用张颖等［14］方法进行氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORACFL）测试。以水溶性的维生素E衍生物Trolox为标准品，计算每克多糖样品相当于Trolox物质的量（μmol），即ORACFL值，以μmol Trolox·g-1表示。

1.3.6黑木耳子实体多糖清除ABTS自由基测试方法

采用张颖等［14］方法，以水溶性的维生素E衍生物Trolox为标准品，计算每克多糖样品相当于Trolox物质的量（μmol），即TEAC值，以μmol Trolox·g-1表示。

2　结果与分析

2.1黑木耳子实体主要化学成分

对照黑木耳与刺五加黑木耳的主要化学成分分析结果见表1。

表1　黑木耳主要化学成分分析Tab.1Chemical components of Auricularia auricula

从表1可以看出，与对照黑木耳比较，刺五加基质栽培的黑木耳的总糖、总蛋白、脂肪含量略有提高，总酚含量比对照黑木耳提高了1.6倍。文献表明［15-16］，在使用木质纤维素栽培木腐菌时，当菌丝体进入分解木质纤维素的阶段，由于一些酶分子量太大，无法深入到木材的内部，木腐菌会产生一些自由基类化合物对木材内部进行攻击，同时会产生多糖、酚类、黄酮类物质进行防御，抵抗自由基对自身的进攻。而且木质纤维素的降解代谢产物会通过生物转化进入菌多糖的合成途径，对木腐菌的多糖生产及组成产生影响。表1中刺五加黑木耳与对照黑木耳的总糖含量均达到55%（wt·wt-1），说明多糖是黑木耳子实体主要的组成成分。因此后期以多糖为主要研究指标，进行了刺五加黑木耳与对照黑木耳多糖的提取，并对所提多糖的化学组成和抗氧化性进行了深入分析比较。

2.2黑木耳子实体多糖理化指标

与对照黑木耳比较，刺五加黑木耳子实体多糖理化指标分析结果见表2。

从表2可以看出，与对照黑木耳相比，刺五加黑木耳酶解、碱提、水提多糖提取物中糖、蛋白质和糖醛酸含量均不同。

酶解刺五加黑木耳多糖提取物含有7.9%的蛋白质，由于纤维素酶酶解方法比较温和，不容易使蛋白发生裂解［17］，因此酶解提取的刺五加黑木耳多糖中能检测到蛋白质的存在，而其它方法提取的黑木耳多糖中，未检测到蛋白质。蛋白多糖复合物是食用菌子实体中重要的功能成分，具有抗氧化、降血糖、抗疲劳等作用，可作为癌症和疱疹病人非特异性免疫刺激的生物应答调节物质，对疾病预防、治疗具有重要应用价值［18］。

表2　黑木耳子实体多糖理化指标Tab.2Physicochemical property on different fractions of Auricularia auricula polysaccharides

进一步对酶解后的黑木耳残渣用1 moL·L-1的NaOH在65℃下进行提取，碱有利于酸性多糖的浸出，可促使多糖与蛋白质间的键裂解，减少多糖中蛋白结合［19］，因此2种黑木耳碱提多糖组分糖醛酸含量均较高，分别为21.3%和18.4%，却均不含蛋白质。

另有文献表明［9-10］，黑木耳子实体中存在碱不溶性多糖，因此最后用二次水清洗碱提残渣，获得的多糖组分水溶性较差，在应用上存在局限性。

2.3单糖组成分析结果

对照黑木耳多糖与刺五加黑木耳多糖的单糖组成分析色谱图见图2。各单糖组分的摩尔百分比结果见表3。

图2　黑木耳多糖的单糖组成气相色谱图Fig.2GC chromatograms on monosaccharide composition of different polysaccharides from Auricularia auricula

表3　不同组分黑木耳子实体多糖的单糖组成Tab.3Monosaccharide composition of different polysaccharides from Auricularia auricula

从图2可以看出，同种提取方式获得的对照黑木耳与刺五加黑木耳多糖的单糖组成基本相同，但摩尔含量均不同。刺五加黑木耳酶解多糖的葡萄糖含量明显降低，半乳糖含量明显增加，半乳糖在单糖组成中的摩尔百分含量为32.4%，是对照的4.8倍；刺五加黑木耳水提多糖由摩尔比1.2∶1的葡萄糖和甘露糖组成，而对照的葡萄糖和甘露糖摩尔比为7.2∶1。单糖组成变化结果与已有报道类似，如Chen等［20］使用玉米秸秆替代普通基础培养基生产Inonotus obliquus菌多糖，发现菌多糖的甘露糖和半乳糖比例均有所提高。文献表明［21］，不同来源的葡甘聚糖、半乳甘露聚糖具有非常明显的抗氧化、抗炎、抗凝血、抗病毒、降血糖脂等功能，还对多种致癌、促癌物有抑制作用。

2.4清除氧自由基能力

对照黑木耳多糖与刺五加黑木耳多糖清除氧自由基的结果见图3。

图3　黑木耳多糖抗氧化性ORACFL值比较Fig.3ORACFLvalues of different polysaccharides from Auricularia auricular

从图3可以看出，刺五加黑木耳酶解多糖和水提多糖的清除氧自由基的能力均强于对照，其中酶解刺五加黑木耳多糖的ORACFL值最高，是对照的3.2倍。

2.5清除ABTS自由基能力

对照黑木耳多糖与刺五加黑木耳多糖清除ABTS自由基的结果见图4。

从图4可以看出，与氧自由基清除能力趋势一致，刺五加黑木耳酶解多糖和水提多糖的清除ABTS自由基的能力均强于对照，其中酶解刺五加黑木耳多糖的TEAC值最高，是对照的2.7倍。

综前所述，含有蛋白的刺五加黑木耳酶解多糖的抗氧化能力最强，其次是甘露糖含量较高的水提多糖。而刺五加黑木耳的碱提多糖清除氧自由基和ABTS自由基的能力均比对照低，说明1 mol·L-1NaOH提取时，碱对多糖结构的破坏性较大，刺五加黑木耳受到碱的影响较大，导致其抗氧化能力较弱。

图4　黑木耳多糖抗氧化性TEAC值比较Fig.4TEAC values of different polysaccharides from Auricularia auricular

3　结论

使用刺五加基质栽培黑木耳，尽管黑木耳子实体中总蛋白、总糖和脂肪含量变化不明显，但是总酚含量和多糖提取物中蛋白含量明显提高。同时黑木耳多糖的单糖组成比例发生改变，抗氧化性提高，如含蛋白的刺五加黑木耳多糖中半乳糖含量提高4.8倍，其氧自由基与ABTS自由基的清除能力分别提高3.2和2.7倍。

［1］LI Yu.Present development situation and tendency of edible mushroom industry in China［C］//18th Congress of the International Society for Mushroom Science.Beijing：International Society for Mushroom Science，2012：3-9.

［2］Zeng WeiCai，Zhang Zeng，Gao Hong，et al.Characterization of antioxidant polysaccharides from Auricularia auricular using microwave-assisted extraction［J］.Carbohydrate Polymers，2012，89（2）：694-700.

［3］周鹏，谢明勇.多糖的生物活性［J］.食品研究与开发，2001，22（2）：6-8.

［4］Meng Lei，Sun Sasa，Li Rong，et al.Antioxidant activity of polysaccharides produced by Hirsutella sp.and relation with their chemical characteristics［J］.Carbohydrate Polymers，2015（117）：452-457.

［5］Gaffney BT，Hügel HM，Rich PA.The effects of Eleutherococcus senticosus and Panax ginseng on steroidal hormone indices of stress and lymphocyte subset numbers in endurance athletes［J］.Life Sciences，2001，70（4）：431-442.

［6］韩波.一种黑木耳的生产方法：中国，200510113129.4［P］. 2006-04-26.

［7］钟鄂蓉，李晓燕，郭莹，等.利用刺五加渣栽培黑木耳的研究［C］//第九届全国食用菌学术研讨会摘要集.上海：食用菌学报，2010：18.

［8］Kim MY，Seguin P，Ahn JK，et al.Phenolic compound concentration and antioxidant activities of edible and medicinal mushrooms from Korea［J］.Journal of Agricultural and Food C-hemistry，2008，56（16）：7265-7270.

［9］王金凤.木耳多糖提取工艺研究［J］.食品科学，2004，25（6）：143-146.

［10］Sone Y，Kakuta M，Misaki A.Isolation and characterization of polysaccharides of“Kikurage”，fruit body of Auricularia auricula-judae［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1978，42（2）：417-425.

［11］谢美华，罗中泽，李霖，等.黄鳞多孔菌多糖提取和抗氧化活性的研究［J］.中国食用菌，2015，34（1）：57-59.

［12］Sheu F，Chien PJ，Chien AL，et al.Isolation and characterization of an immunomodulatory protein（APP）from the Jew's Ear mushroom Auricularia polytricha［J］.Food Chemistry，2004，87（4）：593-600.

［13］姜瑞芝，陈英红，杨勇杰，等.银耳多糖中糖醛酸含量的测定［J］.中草药，2004，35（9）：991-993.

［14］张颖，曾艳，张丽姣，等.不同食用菌菌糠多糖的组分分析与抗氧化活性评价［J］.食品科学，2015，36（5）：18-23.

［15］Chen Huiying，Xue Dongsheng，Feng Xiaoyu，et al.Screening and production of ligninolytic enzyme by a marine-derived fungal Pestalotiopsis sp.J63［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2011，165（7-8）：1754-1769.

［16］Cohen R，Persky L，Hazan-eitan Z，et al.Mn2+alters peroxidase profiles and lignin degradation by the white-rot fungus Pleurotus ostreatus under different nutritional and growth conditions［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2002，102（1-6）：415-429.

［17］杨学敏，陈仪男，李志明.超声波萃取和酶解法提取大杯蕈多糖的比较［J］.莆田学院学报，2011，18（2）：28-32.

［18］Cheeung YC，Siu KC，Liu YS，et al.Molecular properties and antioxidant activities of polysaccharide-protein complexes from selected mushrooms by ultrasound-assisted extraction［J］.Process Biochemistry，2012，47（5）：892-895.

［19］刘海英，范永山，张运峰，等.白灵菇菌丝多糖碱溶液浸提法提取工艺的改进［J］.北京农学院学报，2009，24（3）：53-58.

［20］Chen Hui，Yan Mingchao，Zhu Jinwei，et al.Enhancement of exo-polysaccharide production and antioxidant activity in submerged cultures of Inonotus obliquus by lignocellulose decomposition［J］.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，2011，38（2）：291-298.

［21］Willför S，Sjöholm R，Laine C，et al.Characterisation of water-soluble galactoglucomannans from Norway spruce wood and thermomechanical pulp［J］.Carbohydrate Polymers，2003，52（2）：175-187.

Influence of Eleutherococcus senticosus Substrate on the Chemical Composition and Antioxidant Activities of Auricularia auricular Polysaccharides

ZHANG Ying1，ZENG Yan1，QIU Guang-jun2，LI Xing-shuo1，SUN Yuan-xia1
（1.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China；2.Heilongjiang Guoyu Biological Science and Technology Development Co.Ltd.，Jidong 158200，China）

This study was aimed to investigate the influence of Eleutherococcus senticosus substrate on Auricularia auricular and the chemical composition，antioxidant activities of its polysaccharides，using A.auricular cultivated on ordinary substrate as the control.The contents of total sugar，protein，polyphenol，lipid and ash in the two A.auricular were analyzed.The polysaccharide extracts of the two A.auricular were further prepared by sequently enzymolysis，alkali and water extraction.The chemical composition and antioxidant activity of the polysaccharides were also determined.The results showed that the content of total sugar in the two A.auricular both exceeded 55%（wt·wt-1），the polysaccharides of the two A.auricular were both consisted of glucose，mannose，galactose，xylose and fucose.However，compared to the control，the A.auricular cultivated on E.senticosus substrate had an obvious higher content of polyphenol，and the content of protein was 7.9%（wt·wt-1），and in the monosaccharide composition of its polysaccharide，the content of glucose decreased and the content of galactose obviously increased.The polysaccharide extract containing the polysaccharide-bound protein，which was from A.auricular cultivated on E.senticosus substrate，had a mole content of galactose of 32.4%，about 4.8 times higher than that of the control.Moreover，its oxyradical and ABTS radical scavenging capacities were improved 3.2 and 1.7 times against that of the control.The above results indicated thatE.senticosus substrate could change the metabolic pathway of the active ingredients in A.auricular，and played an important role on the yield of active ingredients and the related bioactivities.

Auricularia auricular；Eleutherococcus senticosus substrate；polysaccharides

S646.6

A

1003-8310（2016）03-0044-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.03.010

中国科学院重点部署项目2013（KSZD-EW-Z-019）；国家农业科技成果转化项目（2014GB2A100504）。

张颖（1980-），女，博士，助理研究员，主要从事食用菌及其天然产物方面研究。E-mail：zhang_ying@tib.cas.cn

**通信作者：孙媛霞（1963-），女，博士，教授，主要从事功能糖及天然产物方面研究。E-mail：syx0430@hotmail.com

2016-03-16