色谱柱选择对六味安消胶囊中大黄素和大黄酚含量测定的影响

王明娟, 刘雅丹, 胡晓茹, 何风艳, 项新华, 戴 忠, 于健东, 马双成

(中国食品药品检定研究院, 北京 100050)



研究论文

色谱柱选择对六味安消胶囊中大黄素和大黄酚含量测定的影响

王明娟, 刘雅丹, 胡晓茹, 何风艳, 项新华, 戴 忠*, 于健东, 马双成*

(中国食品药品检定研究院, 北京 100050)

以中国药典收载的六味安消胶囊中大黄素与大黄酚的含量测定方法为典型案例,揭示了色谱柱是影响HPLC质量控制方法测定结果准确性的关键风险因素。参加能力验证的155家实验室均采用方法规定的C18柱,但由于不同品牌C18柱间的选择性差异,有20家实验室的分析结果中大黄素峰与样品水解产物的色谱峰共流出,导致测定结果明显偏离正常值。统计结果表明,A型(早期开发、硅羟基残留较多)和E型(内嵌极性基团或以极性基团封尾)C18柱更适于六味安消胶囊中大黄素与大黄酚的含量测定,这可能是因为大黄素和大黄酚结构中含有多个酚羟基，能与A型柱的残留硅羟基或E型柱内嵌/封尾的极性基团相互作用，从而增强其保留行为有关。建议相关实验室在制订HPLC质量控制方法时应特别注重色谱柱的耐用性考察,并尝试采用国外色谱柱分类数据库科学地指导色谱柱的选择,尽量采用难分离物质对作为系统适用性指标,完善质量标准,减少由于色谱柱选择不适宜导致测定结果不准确的风险。

高效液相色谱;色谱柱选择;关键风险因素;大黄素;大黄酚;六味安消胶囊

高效液相色谱(HPLC)以其高效、灵敏、专属性强、重现性好等优点成为药品质量控制中常用的技术手段。但在实际工作中,经常因色谱柱选择不适宜而影响HPLC方法定性或定量的准确性,如当目标峰与干扰峰共流出时,会导致定量结果的不准确;当采用相对保留时间(RRT)定义目标峰时,如目标峰的出峰顺序相反,会导致色谱峰识别错误。因为在药典及其他法规HPLC方法中关于色谱柱的描述通常较笼统,如简单描述为C18柱,而不给出色谱柱的品牌信息。目前市场上有800多种品牌的C18柱,由于硅胶纯度、键合工艺、封尾等生产工艺的差异,不同品牌C18柱间的选择性差异较大,而杂化颗粒、聚合物包被、C18链中内嵌极性基团等新技术的出现使上述差异更为显著,更易出现因色谱柱选择不适宜而导致HPLC方法定性或定量结果不准确的风险,特别是当样品基质中含碱性或弱酸性(pKa3～6)化合物时这种差异更为显著[1-5]。

国外已有不少研究团队自20世纪90年代开始研究影响反相色谱柱选择性的参数,并尝试采用重现性好的色谱系统对这些参数进行量化,用于比较不同品牌色谱柱之间的选择性差异。目前比较有国际影响力的研究团队包括Dolan/Snyder等[6-10], Hoogmartens等[11-14]和Euerby等[15-17],所建的色谱柱数据库分别为PQRI(product quality research institute, http://www.usp.org/app/USPNF/columnsDB.html)、KUL(katholieke universiteit leuven, http://pharm.kuleuven.be/farmanalyse/ccs/ccs-app)和ACD(advanced chemistry development, http://www.acdlabs.com/resources/freeware/colsel)数据库。USP(United States pharmacopeia)网站中除PQRI数据库外,还包括依据USP法所建的数据库(以下简称USP数据库,http://www.usp.org/app/USPNF/columnsDB.html)。但PQRI、USP、KUL和ACD数据库均未收载国产色谱柱的信息。 本研究小组成功采用KUL数据库指导了乙酰螺旋霉素组分控制中色谱柱的合理选择[3]。叶六平等[1]采用USP、PQRI数据库指导大黄和补骨脂多组分分析中等效色谱柱的选择,结果表明,对于大黄多组分的分析,PQRI数据库的指导成功率明显高于USP数据库;但在补骨脂的分析中,由于中药样品基质的复杂性,2个数据库的参考价值均较小。

Dolan/Snyder研究团队还曾根据色谱柱的发展史对C18柱进行了分类:A型柱为早期开发的、硅胶纯度较低、金属和硅羟基残留量均较高的色谱柱[6]; B型柱为硅胶纯度较高、金属残留量较低,目前市场占有率最高的色谱柱[7]; E型柱为C18链中内嵌极性基团或以极性基团封尾的色谱柱[8]。

本研究小组在2015年中国食品药品检定研究院组织的“中药六味安消胶囊中大黄素与大黄酚的含量测定”能力验证(PT)项目中发现色谱柱是影响测定结果准确性的关键风险因素,因色谱柱选择不适宜导致测定结果“不满意”的比例高达13%。本文以上述项目中涉及的HPLC方法为典型实例,结合国内外色谱柱的发展史及研究成果,探讨与完善该类质量标准可能的途径,以期为该类共性难题的解决提供有价值的思路。

1 数据库介绍

1.1 PQRI数据库

PQRI数据库中有664种色谱柱信息,包括C4、C8、氨基和苯基柱等。依据色谱柱的疏水性(H)、空间位阻(S)、氢键结合作用的酸性(A)、氢键结合作用的碱性(B)和离子交换作用(C)进行色谱柱分类,用FS(selectivity function)值比较不同色谱柱间的选择性差异,计算公式为[7]

FS=[12.5×(H2-H1)2+100×(S2-S1)2+

30×(A2-A1)2+143×(B2-B1)2+83×(C2-C1)2]1/2

当FS≤3时,认为2根色谱柱的选择性相似;当FS≥6时,认为2根色谱柱的选择性差异显著。

1.2 KUL数据库

KUL数据库中已有100多种品牌色谱柱(主要为C18柱)的信息。依据戊基苯的保留因子(kamb)、苄胺与苯酚在pH 2.7时保留因子的比值(rkba/pH 2.7)、2,2′-联吡啶的保留因子(k2,2′-d)和三亚苯与邻三联苯保留因子的比值(rktri/ter)对色谱柱的选择性进行分类,用F值评价目标色谱柱(i)与参比柱(ref)间的选择性差异,计算公式为[11]

F=(kamb, ref-kamb, i)2+(rkba/pH 2.7, ref-

rkba/pH 2.7, i)2+(k2,2′-d, ref-k2,2′d, i)2+

(rktri/ter, ref-rktri/ter, i)2

当F≤2时,表示目标色谱柱与参比柱间选择性相似;当F≥6时,表示差异显著。

1.3 ACD数据库

ACD数据库中已有321种色谱柱信息,包括C8、氨基柱、苯基柱等。依据苄胺与苯酚在pH 2.7和pH 7.6时保留因子的比值(αB/P, pH 2.7、αB/P, pH 7.6)、咖啡因与苯酚保留因子的比值(αC/P)、戊基苯与丁基苯保留因子的比值(αCH2)、戊基苯的保留因子(kPB)与三亚苯与邻三联苯保留因子的比值(αT/O),用CDF(column difference factor)值比较不同色谱柱间的选择性差异,计算公式为[15]

CDF=[(xnt1-xn1)2+(xnt2-xn2)2+(xnt3-xn3)2+

(xnt4-xn4)2+(xnt5-xn5)2+(xnt6-xn6)2]1/2

其中,上式中的xnt1/xn1、xnt2/xn2、xnt3/xn3、xnt4/xn4、xnt5/xn5和xnt6/xn6分别为目标色谱柱/参比柱关于上述6个参数(αB/P, pH 2.7,αB/P, pH 7.6,αC/P,αCH2,kPB和αT/O)的标准化比值(xnx=(xx-μx)/SD),其中μx和SD分别为该参数的不确定度和标准偏差。CDF越小,表明目标色谱柱与参比柱之间的选择性差异越小。

1.4 USP数据库

采用美国国家标准与技术研究所(national institute of standards and technology, NIST)提供的含尿嘧啶、甲苯、乙苯、醌茜和阿米替林的SRM 870(标准参照物)评价色谱柱的乙苯保留因子(Hy)、醌茜的拖尾因子(CTF)、阿米替林的保留因子(CFA)、阿米替林的拖尾因子(TFA)和结合密度(BD)值,用以反映色谱柱的疏水性、螯合性、硅羟基活性和空间选择性。该数据库中有117种色谱柱信息,通过相似度(F)评价目标色谱柱与参比柱间的选择性差异。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

HPLC仪配有单波长UV检测器或二极管阵列检测器(美国Waters、Agilent、日本Shimadzu公司等)。

甲醇为HPLC级,磷酸为分析级。实验用水采用Millipore纯化水系统制备。

六味安消胶囊购于北京某药店,将包装拆除后用白色塑料瓶套装密封,按20粒/瓶的规格进行分装,共210瓶,随机编号。样品发放前按中国合格评定国家认可委员会(CNAS)相关规定[18,19]进行均匀性和稳定性考察,均符合规定。各实验室按随机表进行样品分配。

2.2 参加实验室情况

参加能力验证项目的实验室共有156家,来自全国31个省、直辖市、自治区(香港、澳门、台湾地区除外),上述实验室中95%为各级药品检验机构,属于药品质量标准的执行主体,另有6家企业实验室和2家第三方检验实验室,能够全面反映本次能力验证所考核质量标准的真实执行水平。最终上报结果的有155家实验室,有1家由于自身原因选择退出。2.3 色谱条件

依据2015版《中国药典》[20],采用的色谱柱为C18柱,流动相为甲醇-0.1%(v/v)磷酸水溶液(80∶20, v/v),检测波长为254 nm,系统适用性为理论塔板数(以大黄素计)不低于3 000。

参加能力验证的155家实验室采用的C18柱包括Waters、Agilent、Shimadzu、Shiseido等公司常见的55种品牌,其中有11家实验室采用的是A型柱,6家为E型柱,138家为B型柱,与C18柱的市场供应情况吻合,能真实反映HPLC质量控制方法在实际执行过程中的状态。

2.4 样品前处理

称取0.6 g样品,加入25 mL盐酸-甲醇(1∶10, v/v)溶液后,加热回流30 min,得到水解样品,以测定总大黄素和总大黄酚的含量;称取0.7 g样品,加入25 mL甲醇,加热回流30 min,测定游离大黄素和游离大黄酚的含量。总大黄素和总大黄酚含量与游离大黄素和游离大黄酚含量的差值即为结合蒽醌中大黄素和大黄酚的含量。

2.5 结果判定

采用稳健统计方法,以总大黄素和总大黄酚的含量、结合蒽醌中大黄素和大黄酚的含量2个指标的Z分比值进行结果评定,计算公式为[18]

Z=(x-X)/(0.741 3×IQR)

上式中的x为各参加实验室的结果,X为稳健统计的中位值,IQR(inter quartile range)为四分位距。

取Z分比值的绝对值(|Z|)进行结果判定,当上述2个指标的|Z|≤2时,结果为“满意”;当2个指标的2<|Z|<3或者其中一个2<|Z|<3而另一个|Z|≤2,结果为“可疑”;当1个或2个指标的|Z|≥3时,结果为“不满意”。

图 1 六味安消胶囊酸水解溶液在不同品牌C18柱下的色谱图Fig. 1 Chromatograms of acid hydrolysis solution of Liuwei Anxiao capsules by different brands C18 columns C18 column: 250 mm×4.6 mm, 5 μm. 1. aloe emodin; 2. emodin; 3. acid hydrolysis product of Liuwei Anxiao capsules; 4. chrysophanol; 5. physcion.

3 结果与讨论

3.1 不同品牌C18柱的分离情况

不同品牌C18柱的分离效果存在显著性差异,仅控制柱效并不能保证色谱柱的分离效果。如图1所示,在相同的色谱条件下,所用的4根色谱柱均为C18柱,均符合系统适用性规定,但其分离效果存在显著性差异。大黄素与大黄酚在XTerra RP18和Spherisorb ODS1柱中的出峰顺序相反;大黄素与样品水解产物(难分离物质对)在XTerra RP18与Spherisorb ODS1柱中能达到基线分离,在Discovery C18柱中仅能部分分离,而在Zorbax Eclipse XDB C18柱中二者共流出。

方法学复核实验中使用的9种C18柱,有5种 C18柱无法将大黄素与样品水解产物基线分离,选择适宜色谱柱的成功率仅为55.6%(见表1)，且高柱效并不能保证上述难分离物质对达到基线分离。这说明仅采用柱效作为系统适用性指标并不适宜,建议改用大黄素与样品水解产物的分离度作为系统适用性指标。

表 1 不同品牌C18柱的分离结果

* based on the peak of emodin; # baseline separation (well separation): the resolutions of emodin and acid hydrolysis product of Liuwei Anxiao capsules (peak 2 and 3 in Fig. 1) was about 1.5 (not less than 1.5);R: resolution of the peak 2 and 3 in Fig. 1; C18column: 250 mm×4.6 mm, 5 μm.

A型和E型C18柱对大黄蒽醌类化合物的分离效果明显优于B型C18柱,这与大黄蒽醌类化合物结构中含多个酚羟基(见图2)可能会与A型柱的残留硅羟基或E型柱的内嵌极性基团(如酰胺基)相互作用,从而增强同系物之间的结构差异有关。

图 2 大黄蒽醌类化合物的结构Fig. 2 Structures of rhubarb anthraquinone compounds

3.2 不同品牌C18柱的测定结果

本次能力验证直接采用大黄素和大黄酚对照品进行色谱峰的定位,虽然E型C18柱中大黄素与大黄酚的出峰顺序与A型和B型C18柱的出峰顺序相反,但均未出现色谱峰定位的错误。各参加实验室中总大黄素和大黄酚的含量与结合蒽醌中大黄素和大黄酚的含量的统计结果见表2。

不同品牌的C18柱的选择性差异是影响测定结果准确性的关键风险因素。如选择的C18柱不能有效分离大黄素与样品水解产物,特别当二者共流出时,总大黄素的测定结果明显偏高。在最终上报的155家结果中,不满意(|Z|≥3)的有36家,其中有21家(包括1家省级药品检验所)选择的C18柱出现了大黄素与样品水解产物共流出的情况,这是导致测定结果不准确的最大风险因素,占不满意结果的58.3%。 A型和E型C18柱测定结果的整体满意率明显高于B型柱,更适于六味安消胶囊中大黄素和大黄酚的含量测定。在本次能力验证中,A型(n=11)和E型(n=6)柱均能将大黄素和水解产物相互分离,整体满意率分别为81.8%(部分实验室由于操作失误导致结果“可疑”)和100%;而B型柱的整体满意率仅为65.9%(n=138),满意率明显偏低,与方法学复核的结果一致。

该方法中大黄素和大黄酚的测定适宜选用包括XBridge Shield RP18、XTerra RP18、Symmetry Shield RP18、Hypersil ODS2、Hypersil BDS C18、Spherisorb ODS1等A型和E型色谱柱以及InertSustain C18和SunFire C18等B型色谱柱。如同时考虑芦荟大黄素、大黄素甲醚等其他特征成分,则Symmetry Shield RP18、XTerra RP18和Spherisorb ODS1色谱柱更适宜。

另外，有26家实验室在能力验证结果中仅注明采用C18柱,而未标注色谱柱的品牌,说明有不少实验室尚未意识到不同品牌C18柱存在选择性差异的风险。这是导致不同实验室测定结果不一致或申请复验纠纷的重要原因,应引起重视。

表 2 不同品牌C18柱的统计结果

表 2 (续)

|Z|≤2, 2<|Z|<3 and |Z|≥3: the results were satisfactory, suspicious or unsatisfactory, respectively, based on robust statistical method[18]; * refer to separation results among emodin, chrysophanol and possible interfering compounds, especially acid hydrolysis product of Liuwei Anxiao capsules; baseline separation (well separation): the resolutions were about 1.5 (not less than 1.5).

3.3 应对措施探讨

本实验采用PQRI、USP、KUL和ACD数据库指导色谱柱的筛选,以4个数据库中均涵盖且分离效果较好的XTerra RP 18色谱柱作为参比柱,将方法学复核和能力验证中各实验室所用典型色谱柱的实际分离效果与各数据库选择性差异的预测结果进行了比较(见表3)。结果表明,PQRI数据库的分辨率最强,能成功预测出XBridge Shield RP18柱的分离效果较好,同时能预测出Symmetry C18、Zorbax Eclipse XDB C18、Discovery C18、Zorbax SB C18等色谱柱不适宜,预测成功率较高;而USP数据库的预测结果与各色谱柱的实际情况差异最大,分辨能力最弱,分离效果好的Symmetry Shield RP18色谱柱与分离效果差的Zorbax SB C18色谱柱的F值差异不显著,且与分离效果无明显对应关系;KUL和ACD数据库对适宜色谱柱的预测有一定指导意义,但由于本方法适宜的色谱柱属于A型和E型色谱柱,而这些类型不同品牌C18柱间的选择性差异较大,很难在同一类型内找到等效色谱柱,从B型柱中更难找到与A型或E型柱等效的色谱柱。

表 3 典型C18柱的实际分离效果与数据库预测结果的比较

PT: proficiency testing; Yes: emodin and chrysophanol could at least baseline separated from possible interfering ones; No: the above requirement couldn’t be met; -: the related columns were not used or unavailable in the corresponding databases; RSD: relative standard deviation of retention times of target compounds; * theFvalue was evaluated based on KUL column characterization system[11-14]; # the smaller theFvalue, more similar the selectivities of the columns.

4 结论

本文以《中国药典》中收载的六味安消胶囊中大黄素与大黄酚的含量测定方法为例,通过能力验证所得的详实数据揭示了色谱柱是影响HPLC质量控制方法测定结果准确性的关键风险因素。提示各相关实验室在起草和执行HPLC质量控制方法时,应考虑色谱柱间的选择性差异,同时重视色谱柱的耐用性考察。建议国家药典委员会等部门能够组织开展难分离样品适宜色谱柱的系统筛选工作并建立相应的数据库,指导色谱柱的合理选择,减少色谱柱间的选择性差异所导致的测定结果不准确。中药样品的基质较复杂,如何在国外色谱柱研究成果的基础上,结合中药特征化合物的结构特点,给出科学、可行的适宜色谱柱预测方案尚需进一步探讨。

致谢 感谢参加能力验证项目NIFDC-PT-035的156家实验室的积极参与和配合。

[1] Ye L P, Sun L, Wang M J, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015, 35(6): 945

叶六平, 孙磊, 王明娟, 等. 药物分析杂志, 2015, 35(6): 945

[2] Zhang W Q, Hu Q X, Zhang X, et al. J Chromatogr A, 2014, 1323: 87

[3] Wang M J, Zheng C, Hu C Q, et al. J Chin Pharm Sci, 2011, 20(11): 572

[4] Wang M J, Li Y P, Hu C Q. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2008, 28(11): 1940

王明娟, 李娅萍, 胡昌勤. 药物分析杂志, 2008, 28(11): 1940

[5] Wang M J, Li Y P, Yang Y L, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2006, 26(1): 102

王明娟, 李娅萍, 杨亚莉, 等. 药物分析杂志, 2006, 26(1): 102

[6] Gilroy J J, Dolan J W, Carr P W, et al. J Chromatogr A, 2004, 1026(1/2): 77

[7] Gilroy J J, Dolan J W, Snyder L R. J Chromatogr A, 2003, 1000(1/2): 757

[8] Wilson N S, Gilroy J J, Dolan J W, et al. J Chroamtogr A, 2004, 1026(1/2): 91

[9] Snyder L R, Maule A, Heebsh A, et al. J Chromatogr A, 2004, 1057(1/2): 49

[10] Snyder L R, Dolan J W, Carr P W. Anal Chem, 2007, 79(9): 3255

[11] Ivanyi T, HeudenY V, Visky D, et al. J Chromatogr A, 2002, 954(1/2): 99

[12] Visky D, Heyden Y V, Ivanyi T, et al. J Chromatogr A, 2003, 1012(1): 11

[13] Dehouck P, Visky D, Heyden Y V, et al. J Chromatogr A, 2004, 1025(2): 189

[14] Visky D, Haghedooren E, Dehouck P, et al. J Chromatogr A, 2006, 1101(1/2): 103

[15] Euerby M R, Petersson P. LC-GC Europe, 2000, 13: 665

[16] Petersson P, Euerby M R. J Sep Sci, 2005, 28(15): 2120

[17] Euerby M R, Petersson P. J Chromatogr A, 2005, 1088(1/2): 1

[18] China National Accreditation Service for Conformity Assessment. CNAS/GL02 Guidance on Statistic Treatment of Proficiency Testing Results and Performance Evaluation. (2014-09-15) [2016-04-12]. http://www.cnas.org.cn/fwzl/nlyzzl/index.shtml

中国合格评定国家认可委员会. CNAS/GL02能力验证结果的统计处理和能力评价指南. (2014-09-15) [2016-04-12]. http://www.cnas.org.cn/fwzl/nlyzzl/index.shtml

[19] China National Accreditation Service for Conformity Assessment. CNAS/GL03 Guidance on Evaluating the Homogeneity and Stability of Samples Used for Proficiency Testing. (2006-06-01) [2016-04-12]. http://www.cnas.org.cn/fwzl/nlyzzl/index.shtml

中国合格评定国家认可委员会. CNAS/GL03能力验证样品均匀性和稳定性评价指南. (2006-06-01) [2016-04-12]. http://www.cnas.org.cn/fwzl/nlyzzl/index.shtml[20] Pharmacopoeia Commission of the People’s Republic of China. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, Part 1. Beijing: China Medical Science Press, 2015: 710

国家药典委员会. 中华人民共和国药典, 一部. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 710

National “12th Five-Year” Projects (No. 2014ZX09304307-002).

Influence of column selection in assay of emodin and chrysophanol in Liuwei Anxiao capsules

WANG Mingjuan, LIU Yadan, HU Xiaoru, HE Fengyan, XIANG Xinhua, DAI Zhong*, YU Jiandong, MA Shuangcheng*

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Column selection is a factor of critical risk that may influence the accuracy of high performance liquid chromatography (HPLC) method. Assay of emodin and chrysophanol in Liuwei Anxiao capsules described in Chinese Pharmacopeia was taken as a typical example. Though 155 laboratories in the proficiency testing program all used C18columns, the 20 ones obtained incorrect results due to the co-elution of emodin and acid hydrolysis product of Liuwei Anxiao capsules in the selected C18columns. Statistical results showed that A-type (early developed columns with higher silicon hydroxyls residues) and E-type (with embedded or end-capping polar group) C18columns were more suitable for the assay of emodin and chrysophanol in Liuwei Anxiao capsules. It might attribute to the presence of phenolic hydroxyl groups in emodin and chrysophanol and interact with residual silicon hydroxyls in A-type columns or polar groups in E-type ones. To reduce the risk of unsuitable column selection, related laboratories should pay more attention to the robustness of columns when HPLC methods are established. The column selection for robustness could be based on peer-reviewed column classification databases, and the resolution of critical pair should be recommended to use as system suitability parameter.

high performance liquid chromatography (HPLC); column selection; critical risk factor; emodin; chrysophanol; Liuwei Anxiao capsules

10.3724/SP.J.1123.2016.08008

2016-08-07

国家“十二五”专项(2014ZX09304307-002).

O658

A

1000-8713(2016)11-1077-07

* 通讯联系人.Tel:(010)67095150,E-mail:daizhong@nifdc.org.cn(戴忠);Tel:(010)67095272,E-mail:masch@nifdc.org.cn(马双成).