H PLC测定三种儿童用医院制剂中防腐剂羟苯乙酯的含量

苏静华顾炳仁邢以文徐忆菁

（1苏州市食品药品检验所，江苏 苏州215000；2苏州大学药学院 ）

H PLC测定三种儿童用医院制剂中防腐剂羟苯乙酯的含量

苏静华1顾炳仁1邢以文1徐忆菁2

（1苏州市食品药品检验所，江苏 苏州215000；2苏州大学药学院 ）

目的：建立测定三种儿童用医院制剂中防腐剂羟苯乙酯含量的高效液相色谱方法，为儿童用医院制剂防腐剂限量控制提供依据。方法：色谱柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，）；流动相：甲醇-水（60∶40，V/V）；等度洗脱；柱温：35℃；检测波长：256 nm；流速：0.8 mL/min。结果：羟苯乙酯浓度在2.292～ 114.6 μg/mL范围内线性关系良好（r=1.000 0）。RSD为0.33%，LOD为0.120 μg/mL，红臀软膏、硫磺霜和复方洁霉素滴鼻液的平均回收率分别为97.41%，98.44%和96.65%（n=6）。结论：该检测方法快捷、简便、准确、可靠，可用于医院制剂中防腐剂羟苯乙酯的检测。

羟苯乙酯；高效液相色谱法；防腐剂；儿童；医院制剂；含量测定

羟苯乙酯是一种高效的防腐剂，为无色结晶或白色粉末，略有麻舌的涩味，易溶于甲醇、乙醇和乙醚，略溶于三氯甲烷，微溶于甘油，几乎不溶于水，无挥发性，无吸湿性；化学性质稳定，在酸性、中性、碱性溶液中均有抑菌作用，对大肠杆菌作用最强［1］。

红臀软膏是以紫草、白芷这两种中药为主要成分，用于治疗婴幼儿臀红的油性基质软膏剂。臀红是临床小儿常见的皮肤疾病，主要症状是皮肤潮红、溃烂甚至脱皮等。5%硫磺霜主要用来治疗儿童疥虫及霉菌感染，其主要成分升华硫，对婴儿湿疹亦有疗效［2］。复方洁霉素滴鼻液是临床用于治疗儿童呼吸道感染的常用药物之一。其处方中的林可霉素是一种抗生素，能抑制细菌的蛋白质的合成，对G+菌及某些厌氧菌有较强杀灭作用［3］；另一种有效成分地塞米松磷酸钠是糖皮质激素类药物，具有抗局部变态反应、抗炎、抗水肿等多种药理作用［4］，对治疗慢性鼻窦炎和哮喘有一定的效果［5］。

因上述三种医院制剂均为多剂量包装，开封后接触空气，易致微生物滋生，故其处方中均添加了一定量的羟苯乙酯，起到抑菌、防腐的作用。羟苯乙酯是一种在食品、药品、化妆品中均广泛使用的防腐剂［6］。尽管现今并未否认羟苯酯类防腐剂使用的安全性，但由于婴幼儿特别是新生儿皮肤角质层薄，且缺乏溶菌素，因此对各种过敏原极其敏感，皮肤、黏膜长期暴露于防腐剂可能引起不同程度的不良反应［7-10］，所以必须控制其用量。另外，羟苯乙酯的抑菌浓度须控制在0.2～0.8 mg/mL之间［11］，因此若在制剂时投料不足，羟苯乙酯浓度很有可能低于下限，从而达不到理想的抑菌效果，因此需要制定防腐剂的含量限度标准。

《中国药典》2015年版仅对部分品种的防腐剂含量限度作出了规定，如左氧氟沙星滴眼液要求控制苯扎溴铵的含量为标示量的80%～120%［12］；妥布霉素滴眼液要求检查羟苯乙酯、羟苯丙酯和苯扎氯铵的含量，为标示量的80%～120%；盐酸林可霉素滴眼液要求苯甲酸钠、苯扎溴铵和羟苯乙酯含量偏离标示量均不得大于±20%。但本文所述的三种儿科用医院制剂在其质量标准中，仅对防腐剂的抑菌效力有检测要求，对于羟苯乙酯在制剂中的具体含量未作测定要求和限度规定。因此，本文建立了一种能快速准确测定医院制剂中羟苯乙酯含量的高效液相色谱方法，为儿童用医院制剂标准提高提供了参考依据。

1 仪器与设备

Waters Alliance e2695高效液相色谱仪（2998型二极管阵列检测器，EmpowerⅡ色谱工作站）；Merck Millipore Direct-Q3超纯水仪；梅特勒-托利多分析天平XS105DC；SHIMADZU UV-2550型紫外分光光度计；科导SK6210HP超声波清洗器。

2 样品与试剂

羟苯乙酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100847-201102，含量：99.9%）；复方洁霉素滴鼻液（苏州大学附属儿童医院，批号：15061401，15061402，15061403）；红臀软膏（苏州大学附属儿童医院，批号：150804，150818，150903）；硫磺霜（苏州大学附属儿童医院，批号：150614，15061402，15061403）。甲醇为色谱纯，试验用水为超纯水。

3 方法

3.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（60∶40，V/V）；等度洗脱；流速：0.8 mL/min；柱温：35℃；检测波长：254 nm。

3.2 样品处理和溶液制备

3.2.1 对照品溶液的制备 取羟苯乙酯对照品约10.0 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密吸取1 mL对照品贮备液至10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度约20 μg/mL的对照品溶液。

3.2.2 供试品溶液的制备

3.2.2.1 复方洁霉素滴鼻液供试品溶液的制备 精密量取复方洁霉素滴鼻液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀释至10 mL，摇匀，作为供试品溶液。

3.2.2.2 红臀软膏供试品溶液的制备 取红臀软膏约 1.0 g，精密称定，置 50 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，超声10 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

3.2.2.3 硫磺霜供试品溶液的制备 取硫磺霜约0.5 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，超声10 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

4 结果

4.1 线性关系

精密吸取上述对照品和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。

图1 羟苯乙酯对照品和三种儿科用医院制剂的HPLC图

取羟苯乙酯对照品约 10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，作为标准母液。精密移取标准母液各1.0，1.0，1.0，1.0，2.0，1.0，1.0 mL，分别置于 10，25，50，100，250，250和500 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，作为系列标准溶液。精密量取上述系列标准溶液各10 μL，在“3.1”项的色谱条件下分别进样。以浓度C（μg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线并进行计算，得羟苯乙酯的线性方程：

Y=56 115.29X-52 628.54（r=0.999 9）。

结果表明，羟苯乙酯的质量浓度在 2.292～114.6 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

4.2 精密度

精密量取“3.2.1”项下质量浓度为22.92 μg/mL的对照品溶液10 μL，在“3.1”项的色谱条件下重复进样6次，峰面积RSD为0.33%（n=6），表明仪器精密度良好。

4.3 稳定性

将“3.2.1”项下质量浓度为22.92 μg/mL的对照品溶液在常温下分别保存0，2，4，8，16，24 h后，在“3.1”项的色谱条件下分别进样10 μL，记录色谱图。羟苯乙酯峰面积的RSD为0.65%（n=6）。表明羟苯乙酯对照品溶液在室温环境下24 h内稳定。

4.4 重复性

精密称取同一批次的红臀软膏（批号：150804）和硫磺霜（批号：150614），精密量取同一批次复方洁霉素滴鼻液（批号：15061402），分别依照“3.2.2”项下的制备方法，各制备6份供试品溶液；按“3.1”项下的色谱条件，分别记录每份供试品溶液羟苯乙酯的峰面积。RSD分别为1.27%，1.20%和1.86%。

4.5 检测限

将“3.2.1”项下的对照品溶液不断稀释后再进样，依据色谱图峰面积，以信噪比 S/N=3计算，得羟苯乙酯的最低检测限为0.120 μg/mL。

4.6 定量限

将“3.2.1”项的对照品溶液不断稀释后进样，依据色谱图峰面积，以信噪比S/N=10计算，得羟苯乙酯的定量限为0.400 μg/mL。

4.7 加样回收试验

取已知含量的红臀软膏（取重复性试验项下的样品，批号：150804）6份，每份约 0.5 g，精密称定，分别置于50 mL容量瓶中；再取已知含量的硫磺霜（取重复性试验下的样品，批号：150614）6份，每份约 0.25 g，精密称定，分别置于 25 mL容量瓶中；另精密吸取已知含量的复方洁霉素滴鼻液（取重复性试验下的样品，批号：15061402）6份，每份1 mL，分别置于6个10 mL容量瓶中。在上述容量瓶中各精密加入羟苯乙酯对照品适量，按“3.2.2”项下的方法制备溶液，在“3.1”项下的色谱条件下分别进样10 μL，记录色谱图。结果表明，红臀软膏、硫磺霜和复方洁霉素滴鼻液的平均回收率分别为97.41%，98.44%和96.65%（n=6），其RSD分别为1.77%，1.33%和4.31%。见表1。

表1 加样回收率试验结果

4.8 样品测定

精密称取或量取各批样品适量，照“3.2.2”项下方法制备供试品溶液后进样测定（表2），HPLC图见图1。结果表明红臀软膏和复方洁霉素滴鼻液中羟苯乙酯的含量均比标示量低，而硫磺霜中的羟苯乙酯略高。

5 讨论

5.1 测定波长的考察

取“3.2.1”项下的对照品溶液，在210～350 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，结果显示羟苯乙酯在256 nm处有最大吸收峰且无溶剂峰干扰，故将测定波长定为256 nm。

5.2 提取方法的考察

为了确定制备供试品溶液的超声时间，本研究做了如下试验。精密称取3份重复性试验项下的红臀软膏（批号：150804）各约1.0 g至50 mL容量瓶中，用适量甲醇溶解，分别超声10，20，30 min后，用甲醇稀释至刻度，用微孔滤膜过滤后分别进样，测定羟苯乙酯的含量。三者峰面积的RSD为3.7%，延长超声时间对羟苯乙酯含量带来的影响可以忽略不计，因此将样品超声时间确定为10 min，以提高提取效率。

表2 三种儿科用医院制剂中羟苯乙酯的测定结果

5.3 阴性样品的考察

由于缺乏制备阴性样品的条件，本文未进行其他辅料的干扰试验，因此对羟苯乙酯含量测定结果的可靠性带来一定影响。

5.4 实测样品数据分析

由表2可以观察到，批号为150903的红臀软膏和其他两个批次的样品相比，羟苯乙酯含量显著偏低，且重复进样后仍有较大偏离，表明该种医院制剂可能在批次间的质量同一性方面控制得较差，但要获得更确切的结论，还需增加测定批次数目。各批次硫磺霜实测结果较为理想，含量均占标示量的80%～120%，且RSD＜3.02%。3个批次的复方洁霉素滴鼻液批次间差异不大，RSD＜2.50%。但含量均偏低，《中国医院制剂标准》规定的羟苯乙酯抑菌浓度是200～ 800 μg/mL，测得羟苯乙酯的平均含量为（263.3±6.3）μg/mL，仅略高于规定浓度下限，占标示量的平均百分数为65.83%，表明防腐剂可能在处方制备过程中有较大损失，从而达不到要求的抑菌效果，处方制备时需要增加抑菌剂投料。但由于该制剂是鼻黏膜用药，较易进入血液循环进而在体细胞中累积，因此还要留意投料上限。

［1］ 崔福德.药剂学［M］.5版.北京：人民卫生出版社，2004：19.

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［3］ 戴自英.实用抗菌药物学 ［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：219-220，225.

［4］ 孙忠实.临床药理学［M］.北京：北京科技出版社，2005：333.

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［7］ 李中东，张云轩，郭燕萍，等.羟苯酯类防腐剂的不良反应［J］.中国药物警戒，2012，9（5）：303-305.

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［12］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版）二部［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：156.

Content Determination of Ethylparaben as a Preservative in Three Hospital Preparations for Children by HPLC

Su Jinghua1，Gu Bingren1，Xing Yiwen1，Xu Yijing2（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215000，China；2 College of Pharmaceutical，Soochow University）

Objective：To develop a HPLC method for determination of content of ethylparaben as a preservative in three hospital preparations for children，and provide a basis for quantitative limit of preservative in the preparations. Methods：The determination was carried out on a Phenomenex Luna C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）serving methanol-ultrapure water（60∶40）as a mobile phase by isocratic elution.The detection wavelength was set at 256 nm，while the flow rate was 0.8 mL/min and the column temperature was 35℃.Results：The linear range of ethylparaben was 2.292～114.6 μg/mL （r=1.000 0）.The RSD was 0.33%and the LOD was 0.120 μg/mL.The average recovery rates of the three hospital preparations，i.e.diaper rash ointment，sulfur cream and compound jiemycin were 97.41%，98.44% and 96.65%，respectively.Conclusion：This method is rapid，simple，accurate and reliable for determination of preservative in hospital preparations.

Ethylparaben；HPLC；Preservative；Children；Hospital Preparation；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.10.004

2016-05-29）

苏静华，女，硕士，主管药师。研究方向：药品质量控制。通讯作者E-mail：susan0702@163.com