核糖体小亚基蛋白S7对结肠癌细胞HCT116迁移的作用初探

段　娟， 徐　燕， 廖之君， 郑志竑， 何　艳



核糖体小亚基蛋白S7对结肠癌细胞HCT116迁移的作用初探

段娟， 徐燕， 廖之君， 郑志竑， 何艳

目的探讨核糖体小亚基蛋白S7(RPS7)对结肠癌细胞HCT116迁移的作用及机制。方法以3种基因型人结肠癌HCT116细胞株(p53野生型，p53-/-，p21-/-)为研究对象，利用pCDNA3.1-s7质粒对rps7基因进行过表达，rps7小分子干扰RNA对rps7基因进行沉默，实时定量PCR检测转染前后细胞rps7 mRNA的表达变化，Transwell细胞迁移实验观察细胞迁移能力的改变。结果3种不同的HCT116细胞株转染了pCDNA3.1-s7质粒后，rps7基因的表达均明显上调，且迁移能力均受到显著促进，增幅大小依次为HCT116 (p53-/-)>HCT116(WT)>HCT116 (p21-/-)；而转染了rps7 siRNA后，rps7基因的表达均明显下调，且迁移能力均受到显著抑制，减幅大小依次为HCT116 (p53-/-)>HCT116 (p21-/-)>HCT116(WT)。结论RPS7对结肠癌细胞HCT116迁移运动的促进作用显著，且该作用与细胞内的P53水平有关，提示RPS7可能通过P53通路或者其他机制在结肠癌细胞HCT116的迁移中发挥重要作用。

核糖体蛋白质类/*生物合成； RNA，小分子干扰； 基因，p53； 细胞运动； 结肠肿瘤； HCT116细胞

结肠癌是临床常见的消化系统肿瘤，居我国恶性肿瘤第3位，其发病率与死亡率有逐年上升的趋势[1]。肿瘤转移是结肠癌高死亡率的主要原因[2]。结肠癌的转移机制非常复杂，这一过程涉及癌细胞的上皮-间质转化、侵袭黏附能力、血管生成、胞外基质降解以及微环境趋化作用[3-4]。研究发现，核糖体小亚基蛋白S7(ribosomal protein S7, RPS7)能够在乳腺癌细胞中与MDM2结合，抑制MDM2调节的P53的泛素化，从而激活P53[5]；而且在斑马鱼模型中，RPS7也能够通过P53通路影响斑马鱼胚胎的发育[6]；在卵巢癌中，RPS7能够通过PI3K/AKT和MAPK信号通路抑制卵巢癌的增殖和转移，值得注意的是，RPS7的缺失同样可以下调p53重要的下游基因——p21[7]。这些研究提示，RPS7在癌症的发生发展中可能发挥重要的作用，并且与P53信号通路密切相关。本研究将利用3种基因型人结肠癌HCT116细胞株(p53野生型，p53-/-，p21-/-)，分别过表达和敲低RPS7，探讨RPS7对结肠癌细胞迁移的作用以及该作用与P53之间的关系，为结肠癌的转移机制及治疗提供新的方向。

1　材料和方法

1.1材料3种基因型人结肠癌HCT116细胞株，HCT116(WT)、HCT116(p53-/-)和HCT116(p21-/-)均由美国德州理工大学的张瑞稳教授馈赠[8]。胎牛血清、McCoy’s 5A培养基、0.25%胰酶(美国Gibco公司)；rps7过表达质粒(pCDNA3.1-s7)以及阴性对照(pCDNA3.1空载体)为本实验室构建；rps7 siRNA双链以及阴性对照(上海吉玛公司)；rps7及actin的上下游引物、Trizol及Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒、SYBR Green定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；Transwell板(美国Corning公司)。

1.2方法

1.2.1rps7 siRNA和过表达质粒的构建提取293T细胞总RNA，反转录成cDNA后特异性扩增rps7基因片段，扩增用的PCR正反引物如下：

5′-CGG GAT CCA TGT TCA GTT CGA GCG CCA AGA T-3′

5′-CCG CTC GAG TTA CAA TTG AAA CTC TGG GAA T-3′

将扩增产物克隆到pCDNA3.1载体，测序鉴定。rps7 siRNA的有效序列如下：

5′-TCGGAAAGCTATCATAATCTTTA-3′[7]

1.2.2细胞培养所有的细胞用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和链霉素的McCoy’s 5A培养基，并置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中进行培养。

1.2.3细胞转染取对数生长期的结肠癌细胞，以每孔4×105个种植于6孔板中培养24 h，将rps7过表达质粒或rps7 siRNA以及阴性对照分别应用Lipofectamine2000进行转染，具体的转染步骤参照试剂盒说明书。转染后24 h收集细胞或进行后续实验。

1.2.4实时定量PCR应用Trizol提取组织或细胞总RNA，并测定RNA浓度及纯度。然后通过反转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，最后通过SYBR Green定量PCR试剂盒进行定量检测，每个反应设3个复孔，引物上下游序列为：

rps7：

上游：5′-TCCGGCTAGTACGCGAATTG-3′

下游：5′-CAGCTGTCAGAGTACGGCTC-3′

actin：

上游：5′-ATGATGATATCGCCGCGCTC-3′

下游：5′-AATCCTTCTGACCCATGCCC-3′

1.2.5体外迁移实验Transwell小室纤维膜孔径为8 mm，24孔板中加入含10%胎牛血清的McCoy’s 5A 500 μL，小室中加入不含血清的 McCoy’s 5A 500 μL，同时每个小室中加入5×104个细胞(过表达RPS7)或1×105个细胞(敲减RPS7)，置于细胞培养箱中连续培养48 h；取出小室，小室下表面的细胞用4%多聚甲醛固定，0.5%结晶紫染色；显微镜下每个小室随机观察5个视野并拍照，计数穿膜细胞数。实验重复3次。

2　结　果

2.1实时定量PCR检测转染后rps7的表达情况实验组3种细胞株HCT116(WT)、HCT116(p53-/-)和HCT116(p21-/-)转染rps7 siRNA(s7 si)48 h后，rps7 mRNA水平均较对照组(con si)显著下降(图1)；而且与对照组(con oe)比较，实验组转染了rps7过表达质粒(s7 oe)48 h后，rps7 mRNA水平均出现显著上升(图1)。

2.2过表达RPS7促进结肠癌细胞的迁移体外迁移实验表明，转染了rps7过表达质粒(pCDNA3.1-s7)后，显微镜下观察穿过小室基底膜的细胞数明显多于转染阴性对照组，差别均具有统计学意义(P<0.01，图2)。但过表达RPS7后，不同细胞迁移能力的增强程度有差异：在HCT116(WT)、HCT116(p53-/-)及HCT116(p21-/-)细胞中，迁移细胞数分别增加了(134.26±14.32)%，(248.70±24.67)%及(52.57±2.63)%。其中HCT116 (p53-/-)细胞与HCT116(WT)细胞比较，迁移能力增幅较大；而HCT116 (p21-/-)细胞与HCT116(WT)细胞比较，迁移能力增幅较小；HCT116 (p21-/-)细胞与HCT116 (p53-/-)细胞比较，迁移能力增幅较小；差别均具有统计学意义(P<0.01)。即过表达RPS7能使3种HCT116细胞的迁移能力均受到显著促进，增幅大小依次为HCT116 (p53-/-)> HCT116(WT)>HCT116 (p21-/-)。

2.3敲低RPS7抑制结肠癌细胞的迁移体外迁移实验表明，转染了rps7 siRNA后，显微镜下观察穿过小室基底膜的细胞数明显少于转染阴性对照组，差别均具有统计学意义(P<0.01，图3)。但敲低RPS7后，不同细胞迁移能力的减弱程度有差异：在HCT116(WT)细胞中，迁移细胞数减少了(64.30±2.14)%；在HCT116(p53-/-)细胞中，迁移细胞数减少了(91.90±1.35)%；在HCT116(p21-/-)细胞中，迁移细胞数减少了(84.97±1.92)%。其中，HCT116 (p53-/-)细胞与HCT116(WT) 细胞比较，迁移能力减幅较大；HCT116 (p21-/-) 细胞与HCT116(WT) 细胞比较，迁移能力的减幅较大；而HCT116 (p21-/-) 细胞与HCT116 (p53-/-)细胞比较，迁移能力减幅略小；差别均具有统计学意义(P<0.01)。表明敲低RPS7能使3种HCT116细胞的迁移能力均受到显著抑制，减幅大小依次为HCT116 (p53-/-)>HCT116 (p21-/-)>HCT116 (WT)。

3　讨　论

在世界范围内每年大约新发100万结肠癌患者。早期结肠癌患者通过手术治疗预后较好，但是晚期患者的5年生存率仅为20%左右，死亡的主要原因是癌细胞转移[1]。本实验选用了3种基因型的人结肠癌细胞株HCT116(p53野生型，p53-/-，p21-/-)，发现RPS7对结肠癌细胞HCT116迁移运动的促进作用显著，且该作用的大小与细胞内的P53水平有关，并且过表达RPS7与敲低RPS7相比，不同的细胞有不同的反应。提示RPS7可能通过P53通路或者其他机制在结肠癌细胞HCT116的迁移中发挥重要作用。

早有文献报道，在某些细胞系中，一些核糖体蛋白，特别是核糖体大亚基蛋白RPL5、RPL11、RPL23，能够直接与MDM2结合来调控P53的活性[9-11]。2007年，有学者发现，RPS7能够通过类似的机制调控P53-MDM2间的相互作用，继而激活P21，是第1个被发现具有该功能的核糖体小亚基蛋白[5]。已有研究表明，在乳腺癌、人骨肉瘤等癌细胞中，过表达RPS7能激活P53和P21[5]；但在卵巢癌、斑马鱼胚胎等细胞中，敲低RPS7反而能激活P53和P21[6-7]。提示RPS7的作用与P53通路密切关联，但是不同的细胞有不同的作用模式。在本试验中，笔者特意选用了3种基因型的人结肠癌细胞株HCT116(p53野生型，p53-/-，p21-/-)，希望探寻结肠癌细胞中RPS7的作用与P53通路间的关系。结果发现，在p53-/-细胞中，RPS7对HCT116细胞迁移的影响更大，即敲除P53后，RPS7的作用效果更明显，表明RPS7能通过P53通路对HCT116细胞的迁移发挥作用。在不同的癌组织和癌细胞中，P53的水平不同，癌症治疗时也需考虑这一因素[12]。但是要阐明RPS7与P53在结肠癌中的作用模式，尚需一系列组织细胞分子生物学实验。

尽管核糖体蛋白最主要的功能是参与蛋白质合成，然而，近年来研究者发现，它们还有许多其他功能。譬如，核糖体小亚基蛋白RPS3可作为NF-κB复合物的一个KH结构域，调节特定基因的表达[13]。本实验结果提示，改变RPS7的表达水平能显著影响3种HCT116细胞(p53野生型，p53-/-，p21-/-)的迁移，表明RPS7还能通过P53以外的其他通路发挥重要作用，暗示在结肠癌细胞HCT116中RPS7有新的作用机制待发现。

综上所述，笔者初步发现RPS7的异常表达显著影响结肠癌细胞HCT116的迁移运动，而且这种作用受P53通路的影响，推测RPS7在结肠癌细胞HCT116的转移中起着非常重要的作用。

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(编辑：何佳凤)

The Discussion of the Effect of Ribosomal Protein S7 on the Migration of Human Colon Cancer Cells HCT116

DUAN Juan, XU Yan, LIAO Zhijun, ZHENG Zhihong, HE Yan

Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China

ObjectiveTo study the effect and mechanism of rps7 on the migration of human colon cancer cells HCT116invitro.MethodsThe three kinds of human colon cancer cells HCT116(p53 WT，p53-/-，p21-/-)were transfected by pCDNA3.1-s7 plasmid to overexpression rps7 gene or rps7 siRNA to silence rps7 gene.The mRNA level of rps7, before and after transfection, was examined by real-time quantitative RT-PCR (QPCR) respectively.Then the migration capability was evaluated by tumor migration assay.ResultsIn three different HCT116 cells, the transfection of pCDNA3.1-s7 plasmid could specifically up-regulate the rps7 mRNA, and the upregulation of rps7 promoted the migration capability with the increased range in the order of HCT116 (p53-/-)> HCT116(WT)> HCT116 (p21-/-).The transfection of rps7 siRNA could down-regulate the rps7 mRNA, and this downregulation suppressed the migration capability, and the decrease range is HCT116 (p53-/-)> HCT116 (p21-/-)>HCT116(WT).Conclusionrps7 obviously promoted the migration of HCT116 cellsinvitro，and the influence was related with P53 level in cells.These results suggest that RPS7 may play an important role in the malignant progression in colon cancer cells HCT116, through P53 pathway or other unknown mechanism.

ribosomal proteins/* biosynthesis; RNA, small interfering; genes, p53; cell movement; colonic neoplasms; HCT116 cells

2016-03-18

福建省自然科学基金青年基金(2013J05048)；福建医科大学博士启动基金(2011BS001)

福建医科大学 基础医学院生物化学与分子生物学系，福州350108

段娟(1982-)，女，讲师，理学博士

何艳. Email: hyhyj2002@163.com

R329.24； R329.25； R341； R394.114； R735.35

A

1672-4194(2016)05-0281-04