兖州卷柏提取物对CCl4致小鼠肝损伤的保护作用

邱丹缨， 温扬敏， 谢永华， 苏　齐



兖州卷柏提取物对CCl4致小鼠肝损伤的保护作用

邱丹缨1， 温扬敏1， 谢永华1， 苏齐2

目的研究兖州卷柏提取物对四氯化碳(CCl4)引起肝损伤小鼠的保护作用。方法48只KM小鼠随机分成6组。Ⅰ组和Ⅱ组为正常对照组和肝损伤模型组，分别每天一次性灌胃20 mL/kg生理盐水；Ⅲ组每天一次性灌胃80 mg/kg水飞蓟素；Ⅳ～Ⅵ组分别每天一次性灌胃40,80,120 mg/kg兖州卷柏提取物。各组连续给药7 d。末次给药2 h后，除正常对照组外，其他各组一次性腹腔注射10 mL/kg的0.2% CCL4。禁食不禁水18 h后，称质量；摘眼球取血，分别测定血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性；颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠肝脏并称质量，另取小鼠肝脏右叶的相同部位，用10%甲醛固定，进行石蜡切片和H-E 染色，检测肝组织病理学变化；取肝脏组织匀浆，测定总抗氧化(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。结果兖州卷柏提取物各剂量组ALT和AST活性均显著低于模型组(P<0.01)，且趋于正常小鼠水平；与模型组比较，兖州卷柏提取物各剂量组均能显著提高肝脏T-AOC和CAT活性(P<0.01)。除低剂量组外，其他实验组与模型组之间SOD活性均存在显著差异(P<0.01)；兖州卷柏提取物能减轻肝组织损伤程度。结论兖州卷柏提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤具有保护作用。

兖州卷柏; 肝损伤,急性; 中药疗法; 疾病模型,动物

由于人们不良的生活习惯以及环境污染等原因，肝炎、脂肪肝、药源性肝损伤等肝脏疾病的发病率呈逐年增加的趋势，肝病的预防与治疗对提高人民健康水平具有重要意义[1]。西药在治疗肝病过程中存在成本高、耐药性和副作用强等局限性，而中药具有其独特的作用[2]。在肝脏疾病的预防和治疗过程中，多种中药及中药提取物的保肝功效得到证实，并在临床实践中得到广泛应用。中药具有疗效好及安全实惠等优势，因此在疾病的治疗和预防保健领域日益受到关注[3]。

兖州卷柏(Selaginellainvolvens，Spring)为多年生草本植物，又名地柏枝，金扁桃、石卷柏等[4]。兖州卷柏在民间作为中草药治疗肝炎等被广泛应用，并具有显著疗效，但其保肝有效物质及机制还不清楚[5-6]。本研究拟探讨兖州卷柏提取物对四氯化碳(CCl4)致小鼠肝损伤的保护作用，为开发新型保肝产品及兖州卷柏药用价值的利用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料从福建省宁化县治平乡泥坑村采集兖州卷柏全草，经泉州市医药研究所苏齐主任医师鉴定。总抗氧化(total antioxidant, T-AOC)活性试剂盒、过氧化氢酶(catalase, CAT)试剂盒、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)试剂盒、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购买自南京建成生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1兖州卷柏提取物制备兖州卷柏用清水冲洗干净后晒干，放入粉碎机中粉碎。称取粉碎后粉末0.5 kg倒入玻璃瓶中(5 L)，加入无水乙醇溶液浸泡，最终使其固液比为1∶10(kg/L)。10 d后过滤取滤液。用旋转蒸发仪蒸发，得到兖州卷柏浸膏，其提取率约为1.63%。

1.2.2动物分组SPF级KM小鼠[合格证号SCXK(沪)2012-0002]购自斯莱克实验动物有限公司。体质量24～27 g，于实验室自由饮水和摄食，适应性饲养1周后用于实验。取48只小鼠，随机抓取分为Ⅰ～Ⅵ组：(1)Ⅰ组为正常对照组，Ⅱ组为CCl4急性肝损伤模型组。2组均按每天20 mL/kg的剂量一次性灌胃生理盐水。(2)Ⅲ组为阳性对照组，每天一次性灌胃80 mg/kg水飞蓟素水溶液。(3)Ⅳ～Ⅵ组为低、中、高剂量组，分别每天一次性灌胃40,80,120 mg/kg兖州卷柏提取物水溶液。各组连续给药7 d[7-8]。末次给药2 h后，除正常对照组外，其他各组小鼠按照10 mL/kg的剂量一次性腹腔注射0.2%的CCl4石蜡溶液。

1.2.3检测指标(1)各组小鼠禁食但自由饮水18 h后，称质量。(2)摘眼球法取血，测定血清中ALT和AST活性。ALT和AST用分光光度计505 nm波长测量吸光值，根据标准曲线计算相应酶活性。(3)颈椎脱臼法处死小鼠，分别取小鼠肝脏并称质量，计算肝脏系数(肝脏系数为小鼠肝脏湿质量占处死前体质量的百分比)。(4)观察肝脏颜色、光泽，触摸弹性等，取小鼠肝脏右叶的相同部位一块组织，用10%甲醛固定，进行石蜡切片和H-E染色，光学显微镜下观察肝组织病理变化。(5)取肝脏组织匀浆，用预冷蒸馏水制成10%的肝匀浆，4 ℃ 4 000 r/min离心10 min，取上清液，测定T-SOD、T-AOC和CAT活性。

2　结　果

2.1兖州卷柏提取物对小鼠生长和肝脏系数的影响造模前，实验小鼠生长良好，毛色光滑；造模后，除正常对照组外，其他各组小鼠毛发蓬乱，反应迟钝，但无小鼠死亡。实验结束后，与正常对照组比较，各组小鼠体质量差别无统计学意义(P>0.05)；各组肝脏系数增大，但差别无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，兖州卷柏提取物处理各组肝脏系数减小，而高剂量组与模型组之间差别具有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2兖州卷柏提取物对小鼠血清ALT和AST活性的影响CCl4肝损伤小鼠血清的ALT和AST活性显著高于正常对照组小鼠(表2)，表明肝损伤模型构建成功。各浓度兖州卷柏提取物处理的小鼠ALT和AST活性均显著低于模型组，且趋于正常小鼠水平，表明兖州卷柏提取物具有抑制因肝损伤引起的ALT及AST升高的作用。

表1兖州卷柏提取物对小鼠生长和肝脏系数的影响

Tab 1Effect of ethanol extract from Selaginella involvens(EESI) on the growth and liver coefficient in mice

分　组m小鼠/gm肝/g肝脏系数/%Ⅰ组32．76±2．481．36±0．054．15±0．18Ⅱ组31．24±2．731．70±0．145．50±0．81Ⅲ组32．54±1．731．71±0．18☆☆5．31±0．66☆△Ⅳ组31．77±2．361．60±0．11☆☆5．06±0．50Ⅴ组31．53±1．291．53±0．09☆△﹟4．86±0．40Ⅵ组32．28±1．711．45±0．09△△﹟﹟4．50±0．49△

n=8.Ⅰ组:正常对照组; Ⅱ组:肝损伤对照组;Ⅲ组:阳性对照组; Ⅳ组:低剂量组; Ⅴ组:中剂量组; Ⅵ组:高剂量组.与Ⅰ组比较，☆:P<0.05,☆☆:P<0.01; 与Ⅱ组比较,△:P<0.05,△△:P<0.01; 与Ⅲ组比较,﹟:P<0.05,﹟﹟:P<0.01.

表2提取物对肝损伤小鼠血清ALT和AST活性的影响

Tab 2Effect of EESI on serum ALT and AST in mice of liver injury

U/L

n=8.ALT:谷丙转氨酶; AST:谷草转氨酶.Ⅰ组:正常对照组;Ⅱ组:肝损伤对照组;Ⅲ组:阳性对照组;Ⅳ组:低剂量组;Ⅴ组:中剂量组;Ⅵ组:高剂量组.与Ⅰ组比较，☆:P<0.05,☆☆:P<0.01;与Ⅱ组比较,△△:P<0.01;与Ⅲ组比较,﹟:P<0.05,﹟﹟:P<0.01.

2.3兖州卷柏提取物对小鼠CAT、T-AOC及SOD活性的影响CCl4肝损伤造模后，小鼠CAT、T-AOC和SOD活性显著降低。与模型组比较，兖州卷柏提取物各剂量组均能显著提高肝脏T-AOC和CAT活性(P<0.01，表3)。除提高肝脏T-AOC和CAT活性低剂量组外，其他实验组与模型组之间SOD活性均存在显著差异(P<0.01)。

表3　提取物对肝损伤小鼠肝匀浆组织CAT、T-AOC、SOD活性的影响

n=8.CAT:过氧化氢酶； T-AOC：总抗氧化能力； SOD：超氧化的物歧化酶.Ⅰ组:正常对照组;Ⅱ组:肝损伤对照组;Ⅲ组:阳性对照组;Ⅳ组:低剂量组;Ⅴ组:中剂量组;Ⅵ组:高剂量组.与Ⅰ组比较，☆☆:P<0.01;与Ⅱ组比较, △△:P<0.01;与Ⅲ组比较,﹟:P<0.05,﹟﹟:P<0.01.

2.4兖州卷柏提取物对小鼠肝脏形态学的影响解剖小鼠肝脏显示(图1)，正常对照组小鼠肝脏表面光滑，颜色褐红，触感柔软(图1A)；模型组小鼠肝脏颜色浅红带乳白色，触感较硬(图1B)。而各兖州卷柏处理组(图1D、E、F)和阳性对照组(图1C)小鼠肝脏外观、色泽介于正常对照组与模型组之间。表明兖州卷柏提取物对肝脏有明显保护作用。

2.5兖州卷柏提取物对小鼠肝脏组织的影响正常对照组小鼠肝组织表现正常，无损伤(图2A)。而模型组小鼠肝脏组织有大量的脂肪变性，细胞核明显减小，结构不清晰，细胞边沿不完整，出现水肿和气球样变(图2B)。兖州卷柏提取物各剂量组肝细胞损伤、坏死等病理均有不同程度的缓解，且高剂量组肝损伤程度较轻(图2D、E、F)。

3　讨　论

由于药物种类增多和使用不合理等原因，药物性肝病的发病率在我国不断增加。在肝病患者中，有l%～5%是由于药物导致肝损伤引起的；在急性肝炎和暴发性肝衰竭患者中，由药物引起的肝损伤分别占10%和30%[9]。如何预防药物性肝损伤在临床上越来越受到重视。合理使用保肝药物是预防药物性肝损伤的有效途径之一，已发现有些中草药具有价格便宜、毒副作用小等优势，多种中药被证实对肝细胞和组织具有促进再生和修复、减少损伤的作用，并能恢复受损的肝脏功能[10]。

我国民间有长期使用兖州卷柏治疗肝炎的传统。据《福建民间草药》记载：兖州卷柏具有清肝利胆，特别是对黄疸型肝炎有较好治疗效果[11]。在广东仁化县，民间也常用兖州卷柏熬水内服治疗肝炎并得到较显著的疗效[6]。林美珍等对20例肝炎患者使用兖州卷柏进行治疗，其中1例为丙型肝炎,其余为乙型肝炎；治疗前采用二对半快速检测，血清标志物均阳性，但无明显黄疸。治疗采用兖州卷柏鲜草(10～20 g)或晒干(3～4 g)煎汤内服，3月后再次采用二对半检测，发现血清乙型肝炎病毒(HBV)标志物阴转，转氨酶降至正常，症状、体征明显改善[5]。

CCl4是常用的化学性肝损伤诱导剂，CCl4进入体内以后，经过代谢激活在肝脏发生过氧化反应产生氧自由基，自由基诱发脂质过氧化，导致肝细胞坏死和凋亡，破坏肝细胞结构和功能[8]。本研究表明，兖州卷柏提取物对由CCl4导致的小鼠血清ALT和AST升高具有缓解作用，同时对肝细胞坏死和损伤具有保护效果，表明兖州卷柏可能具有一定的药用开发价值。加强兖州卷柏保肝护肝效果及机制研究对利用其研发新型肝病药物具有重要意义。

人体内存在的CAT、SOD和谷胱甘肽过氧化酶等抗氧化酶类，以及胡萝卜素、维生素、还原性谷胱甘肽等抗氧化剂能清除体内的活性氧自由基，减少自由基对人体的损伤[12]。除利用人自身的机制清除多余的自由基之外，一些外源性的物质也具有清除自由基作用。因此，寻找和发掘外源性物质，清除人体内多余的自由基，减少对人体的损伤具有重要意义[13]。兖州卷柏具有较强的体内体外抗氧化活性。兖州卷柏水提物的总抗氧化活性大小与浓度具有明显的函数关系，随着浓度增加，总抗氧化能力升高[14]。Seong等研究表明，兖州卷柏提取物表现较强抗氧化活性，能抑制NO的产生和iNOS/IL-1β的表达，能清除自由基，表现较强抗氧化作用[15]。笔者前期研究也表明，从兖州卷柏中分离出的生物碱类化合物具有清除DPPH自由基活性、提高大鼠肝脏匀浆的T-AOC活性、降低NOS活性以及清除MDA含量的功能[16]。本研究结果与前期结论相似，显示兖州卷柏提取物能提高小鼠肝脏T-AOC、CAT和SOD活性，表明其保肝作用机制可能与提高机体抗氧化酶活性等作用有关。

水和乙醇是提取中药成分的两种主要溶剂，乙醇为半极性溶剂，可以溶解生物碱及其盐类、甙类、糖、苦味质水溶性的某些成分；又能溶解非极性溶剂所溶解的树脂、挥发油、内酯、芳烃类化合物等。研究表明，从兖州卷柏提取物中进一步分离出的生物碱类化合物对H22肝癌细胞具有体外抑制效果，提示应用乙醇能从卷柏中提取有效化学成分[17]。本研究分析兖州卷柏提取物对CCl4致小鼠肝损伤的预防保护作用，为兖州卷柏药用价值开发及有效单体化合物的分离提供实验依据。另外，植物根、茎、叶等不同部分的化学成分常存在一定差异，植物不同部分的治疗效果也存在一定差异。由于传统兖州卷柏用药多使用全草，本研究提取兖州卷柏全草乙醇提取物，表明其对CCl4致小鼠肝损伤具有保护效果。兖州卷柏根、茎、叶等不同部分成分及治疗效果差异有待进一步研究。

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(编辑：常志卫)

Protective Effect of Ethanol Extract from Selaginella Involvens on Carbon Tetrachloride-Induced Hepatic Damage in Mice

QIU Danying1, WEN Yangmin1, XIE Yonghua1, SU Qi2

1. Department of Basic Medicine, Quanzhou Medical College, Quanzhou 362011, China;2. Quanzhou Medical and Pharmaceutical Institute, Quanzhou 362000,China

ObjectiveTo evaluate the hepatoprotective effect of ethanol extract fromSelaginellainvolvens(EESI) on carbon tetrachloride (CCl4)-induced hepatic damaged mice.MethodsThe animals were randomly divided into six groups, and treated as follows: GroupⅠ and GroupⅡ were normal control group and model group, and they were both given 20 mL/kg normal saline.Group Ⅲ were given 80 mg/kg silymarin.Group Ⅳ, Ⅴ and Ⅵ were given EESI with the dose of 40, 80, 120 mg/kg respectively.All groups were given medicines or normal saline via intragastric administration once a day lasting for 7 days.2 h after the last intragastric administration, all animals were given 0.2% CCl4with the dose of 10 mL/kg except normal control group.After 18 h, all animals were weighted and blood sample were collected by eye bleeding method.The activities of alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase(AST) of blood sample were evaluated.Following the sacrifice for all the animals, the livers were dissected.Thereafter, the activities of total antioxidant capacity (T-AOC), catalase(CAT) and superoxide dismutase(SOD) of liver supernatant were tested.The livers were fixed in 10% formaldehyde at room temperature for histological analysis.ResultsAdministration of EESI significantly reduced the level of ALT, AST(P<0.01).Compared with model group, administration of EESI could significantly enhance the level of T-AOC, CAT(P<0.01).Groups other than the low dose group, significant differences in SOD activity existed between model group and EESI administration groups(P<0.01).Administration of EESI could alleviate liver injury in sinusoidal spaces in CCl4-induced hepatic mice.ConclusionEESI may protect hepatic injury in CCl4-induced mice.

selaginella tamariscina; liver injuries, acute; zhong yao liao fa; disease models, animal

2016-04-26

泉州市科技重点项目(2012Z76)；福建省卫生厅青年基金项目(2013-2-132)

1.泉州医学高等专科学校 基础医学部,泉州362011；

2.泉州市医药研究所 医药研究室，泉州362000

邱丹缨(1968-)，女，副教授. Email: 8192985@qq.com

R-332； R575； R657； R932

A

1672-4194(2016)05-0285-05