分子生物学方法鉴定药用贝母的研究

朱兆宇+焦红见

贝母我国中药材之中是一种常见的品类，其药用历史非常悠久，在当前任然属于非常贵重的中药材。目前，我国以及发现的贝母属以及其变种植物有超过五十种之多，分布地域也及其广泛，随着中药材的商品价值不断提升，有许多诸如土贝母之类的伪劣品也在市场上大量出现。药用贝母从其形态上去看差别非常细微，但是其化学成分和药用价值的差别却是巨大的，所以如何有效的鉴定药用贝母一直以来都是一项重要的研究课题。近年来，对于分子生物学技术的研究取得了长足的进步，其在中药材鉴定领域的应用也正在变得越来越广泛，本文采用PC-RFLP技术对贝母样品进行了分子鉴定研究。

药用贝母及其鉴定现状介绍

贝母是我国中医学之中常用的贵重药材之一，其本身是指百合科贝母属多种植物的鳞茎，味苦性寒，具备化痰止咳、清热散结以及润肺等多种药用功能，在咳嗽痰热类的多种病症治疗中有广泛的应用。目前我国药典中收载的药用贝母为百合科贝母属9种植物：浙贝母、平贝母、伊犁贝母、新疆贝母、川贝母、湖北贝母、暗紫贝母、梭砂贝母、甘肃贝母的新鲜或干燥鳞茎。由于我国贝母产地众多，且形态差异不大，所以在鉴定方面一直存在一定的问题，对药用贝母的临床应用安全性有很大影响。在我国对于中药材的鉴定长期采用性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等几种方法，但是这些传统的鉴定的方法在当前已经不能满足中药发展的要求，分子生物学的发展为药用贝母的鉴定带来全新的局面。分子生物学鉴定方法的应用使得鉴定手段越来越丰富，把中药鉴定从形态扩展到了DNA，这就大大提高了药用贝母鉴定的效率，增强了其临床应用的安全性。

资料和方法

试剂。除限制性内切酶HinfI、BcnI和Psp1406I；lmol/L的Tris-HCI（12.1g Tris-Base溶于800ml水中，加入浓HCI用酸度计调节pH至8.0，加水定容至IL）；O.5mol/L的EDAT（186.1g乙二胺四乙酸二钠溶于700ml水中，用10mol/L Na0H调节pH8.0，加水定容至IL，高温灭菌后备用）；10*TBE（108g Tris-Base溶于800ml水中，加入55g硼酸和40ml o.5mol/L EDAT，pH8.0，加水定容至IL）；凝胶载样缓冲液（含50%甘油，0.25%澳酚蓝，4℃保存）；O.5mg/ml溴乙锭（EB）工作液（加入凝胶的终浓度为o.5ug/ml）。

方法。将各种贝母的5s区的PCR扩增产物，分别以Bcnl、HinfI和Psp1406I限制性内切酶水解（37℃，4小时），随后65℃变性处理10分钟以终止反应，取出在2%的琼脂凝胶上电泳，上样量为每个样品8uL。Hinfl酶切体系：20uL反应体系中含有10xBuffer 2uL，HinfI0.5uL（10u/uL），模板溶液6uL，超纯无菌水适量（补足20ul）；BcnI酶切体系：20uL反应体系中含有10xBuffer2uL，BcnI0.6uL（10u/uL），模板溶液6uL，超纯无菌水适量（补足20ul）；Pspl406I酶切体系：20uL反应体系中含有10xBuffer 2uL，Psp1406I1.2ul（10u/uL），模板溶液6uL，超纯无菌水适量（补足20ul）。

结果

根据各贝母的5s区测序结果，找出了暗紫贝母有而其它贝母无的位点（在5端316bp），用PirmeirPmer5.0软件筛选出BcnI，并用该软件确定其它贝母的5s区全序列均无此酶切位点，因此理想的酶切结果应为：暗紫贝母的5S区PCR产物被切成316bp和370bp两段，其它贝母仍保留700bp左右的原长度，这主要是因为5SrDNA在细胞中以高度重复排列的方式存在，虽然由于同步进化的力量，这些重复单位间已接近纯合，但父母本的差异以及环境因素的影响仍能导致杂交现象的产生（即各拷贝之间存在着少许差异），因此在实际酶切时，仍有少部分PCR产物不能切开，而非酶切不完全的缘故（研究证明将酶量加大，酶切时间延长后电泳结果均无变化）。此外，根据湖北贝母在3184bp处的特异位点选择出Psp1406I，该酶在其它贝母的5s区均无酶切位点。

同样根据各贝母的5s区测序结果，找出了梭砂贝母在5端278bp处的特异位点，用Pirmepirmer5.o软件筛选出HinfI，并用该软件在各种贝母（包括梭砂贝母）5s区全序列中寻找有无该酶切位点，结果表明：梭砂贝母、浙贝母、蒲忻贝母、甘肃贝母、暗紫贝母分别在5端49与275、615、615、624、616bp处均有该酶的酶切位点，理想的酶切结果应为酶切后梭砂贝母为49bp、229bp、407bp三条带；浙贝母为615bp和58bp两条带；蒲沂贝母为615bp和58bp两条带；甘肃贝母为624bp和58bp两条带：暗紫贝母为616bp和58bp两条带。所有被切后50bp左右的小片段在电泳图上都几乎看不见，这主要是由于小分子量的DNA片段在电泳的过程中易发生扩散，梭砂贝母被HinfI酶切后具有特异性的酶切图谱，且该法在药材的鉴定上也很稳定。

讨论

在贝母属的众多植物当中，川贝母是我们日常生活中最为常见的一种中药材，其对治疗咳嗽疾患有非常好的治疗效果。近年来，随着人们对中药材需求量的日益增加，川贝母由于生长的速度十分的缓慢，并且对生长的条件要求也十分苛刻，所以其野生资源的数量是远远不能够满足临床应用需求的，现已被国家列入了保护药材物种。以川贝母入药去治疗咳喘疾病，在我国有着悠久的历史，久而久之人们便认为川贝母是质量上乘的药材，再加上近年来市场需求量的增加，现在的川贝母价格十分昂贵，因此，市场上有大量以次充好的伪品出现，其中以浙贝母幼小鳞茎去冒充的最多。而从以上的鉴定研究可以看到，不同品类的贝母之间存在非常大的差异，其药用价值也必然是完全不一样的，浙贝母的毒性就远远高于川贝母，所以在临川应用的过程中，其治疗效果自然是会有天壤之别的。对于药用贝母的正确鉴定不仅仅只是关系患者的利益，对于我国中医药学的整体进步和发展也有着非常重要的积极作用。