响应面优化超声波微波辅助提取葵花籽绿原酸工艺

刘振春,钱　月

(吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)



响应面优化超声波微波辅助提取葵花籽绿原酸工艺

刘振春,钱月

(吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

【目的】 以葵花籽仁为原料，优化提取绿原酸的工艺条件。【方法】 以乙醇为提取溶剂，绿原酸提取率为指标，采用超声波微波辅助法提取葵花籽绿原酸，在单因素试验的基础上，选取液料比、超声波功率、微波功率为影响绿原酸提取率的主要因素，采用响应面试验方法对绿原酸提取工艺进行优化，并对绿原酸提取率的二次回归模型进行分析。【结果】 单因素试验结果表明，绿原酸的提取率随着液料比的增加呈现先增大后保持不变的趋势，而随着乙醇体积分数、超声波功率、微波功率、微波辐射时间的增加呈现先增大后减小的变化趋势。响应面法优化的绿原酸最佳提取工艺条件为：液(mL)料(g)比25.47∶1，超声波功率307.1 W，微波功率539.36 W。经过修正得到的最佳工艺条件为：液料比25∶1，超声波功率300 W，微波功率540 W，乙醇体积分数65%，微波辐射时间90 s，此时绿原酸的提取率最高，可以达到3.27%。【结论】 超声波微波辅助法提取葵花籽绿原酸具有操作简单、时间短、提取率高等特点。

葵花籽；绿原酸；超声波；微波；响应面法

向日葵(HelianthusannuusL.)系菊科(Compositae)向日葵属(Helianthus) 植物，别名葵花、望日莲、向阳花[1]等。作为一种适应能力极强的油料作物，被广泛栽培于世界各地。向日葵起源于北美洲，目前我国种植面积最大的省区是内蒙古自治区，我国年总产量居世界第6位[2]。葵花籽中含有1.1%～4.5%的绿原酸，绿原酸在高温、光照等条件的影响下可以发生氧化和水解，因此提取过程中要避免氧化现象的发生。绿原酸是葵花籽中重要的生物活性成分[3]，同时是国际公认的“植物黄金”，具有抑制突变和抗肿瘤[4]、缩短血凝时间、保护心脑血管、抗病毒、清除体内自由基、治疗糖尿病等多种作用[5-9]。此外，绿原酸还被广泛应用于食品、医药及化妆品等领域[10-12]。因此，从葵花籽仁中提取绿原酸具有重要的经济价值。

近些年来，陆续建立了很多从葵花籽中提取绿原酸的方法，包括超声波提取法、微波提取法﹑乙醇回流法、水浸提取法、酶提取法等[13]。其中超声波提取法利用了在超声波空化及粉碎的特殊作用下，细胞在溶剂中瞬间产生的空化泡崩溃而破裂，使溶剂渗透到细胞内部，从而使细胞中的成分溶于溶剂之中，由此提高了有效成分的提出率[14]。微波提取法是将热量直接作用于分子的加热过程，与普通加热相比，更能达到能量充分利用的效果[15-16]。超声波结合微波提取作为一种优良的提取方法,具有操作简便快捷、提取时间短、提取率高、提取物的结构未被破坏等特点,目前已广泛应用于生物活性物质的提取[17]。本研究将超声波和微波提取法有效结合，利用响应面优化并以回归分析确定提取葵花籽绿原酸的最优工艺条件，以期为绿原酸的进一步开发应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

葵花籽，市售；绿原酸标准品，纯度≥98%，中国生物制品研究所产品；无水乙醇，分析纯。

1.2仪器与设备

电子天平，上海精天电子仪器有限公司；高速多功能粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司；变频微波炉，美的微波炉电器制造公司；TU-1901紫外分光光度计，北京普希通用仪器有限责任公司；JY99-2D超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；LXJ-B离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3试验方法

1.3.1标准曲线的绘制准确称取绿原酸标准样品10 mg，用无水乙醇定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的绿原酸标准溶液。分别准确量取1，3，5，7，9 mL溶液于10 mL容量瓶中，用无水乙醇定容。用无水乙醇作空白对照在波长200～600 nm扫描，确定绿原酸的最大吸收波长为328 nm。用紫外分光光度计，在波长328 nm处测定吸光度，并以吸光度A为纵坐标(Y)、绿原酸质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)绘制标准曲线[18]。

1.3.2葵花籽绿原酸的超声波微波提取将新鲜的葵花籽手工去壳，经过高速多功能粉碎机粉碎，过孔径0.246 mm(60目)筛后，置于干燥箱中60 ℃干燥至恒质量。在CO2流量为40 kg/h、萃取温度45 ℃、压力30 MPa、时间120 min的操作条件下，进行超临界CO2萃取，将脱脂后的葵花籽粉末置于干燥箱中60 ℃干燥并冷却至恒质量。准确称取1.00 g脱脂葵花籽粉末溶于体积分数70%的乙醇溶液中，置于锥形瓶中浸泡24 h，然后于超声波细胞粉碎机中提取，再在微波条件下处理120 s后，将提取物取出冷却。4 000 r/min离心15 min得提取液为绿原酸，在波长328 nm下测其吸光度，然后由回归方程计算出待测样品的绿原酸含量，用下式计算出绿原酸的提取率：

式中：C为标准曲线绿原酸的质量浓度(μg/mL)，n为稀释倍数，V为配成溶液的体积(mL)，m为葵花籽样品的质量(g)。

1.3.3单因素试验以绿原酸提取率为指标，准确称取葵花籽粉末1.000 0 g，选取乙醇体积分数、液(mL)料(g)比(下同)、超声波功率、微波功率和微波时间作为影响葵花籽绿原酸超声波微波提取的单因素，每组试验进行3次平行试验，取其平均值，绿原酸提取的各影响因素的单因素试验条件如下：

(1)乙醇体积分数。固定微波功率500 W，微波处理时间60 s，液料比25∶1，超声波功率300 W，乙醇体积分数分别设为45%，55%，65%，75%和85%，得出不同乙醇体积分数下的绿原酸提取率，确定最佳乙醇体积分数。

(2)液料比。固定微波功率500 W，微波处理时间为60 s，乙醇体积分数65%，超声波功率300 W，液料比分别设为15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1，得出不同液料比下的绿原酸提取率，确定最佳液料比。

(3)超声波功率。固定微波功率500 W，微波处理时间60 s，乙醇体积分数65%，液料比25∶1，超声功率分别设为200，250，300，350和400 W，得出不同超声波功率下的绿原酸提取率，确定最佳超声波功率。

(4)微波功率。固定微波处理时间为60 s，乙醇体积分数65%，料液比25∶1，超声波功率300 W，微波功率分别设为200，300，400，500，600 W，得出不同微波功率下的绿原酸提取率，确定最佳微波功率。

(5)微波时间。固定微波功率500 W，乙醇体积分数为65%，料液比25∶1，超声波功率300 W，微波辐射时间分别设为30，60，90，120和150 s，得出不同微波时间下的绿原酸提取率，确定最佳微波辐射时间。

1.3.4Box-Behnken响应面优化试验在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理选取液料比、超声波功率、微波功率3个变量，采用响应面分析法对其进行优化，以提取率为考察值，设计三因素三水平的响应面试验。试验因素与水平见表1。

1.4数据处理

采用响应面分析软件进行试验数据处理，选择对葵花籽绿原酸提取率影响较大的液料比、超声波功率、微波功率3个因素进行统计分析，用Excell软件绘图。

2　结果与分析

2.1绿原酸的标准曲线及回归方程

在最大吸收波长328 nm下，测定不同质量浓度绿原酸标准品溶液的吸光度，以吸光度为纵轴(Y)、绿原酸质量浓度为横轴(X)绘制绿原酸标准曲线(图1)。由图1可知，绿原酸质量浓度-吸光度标准曲线回归方程为Y=0.02X+0.173 3，R2=0.993 9。

图 2乙醇体积分数对葵花籽中绿原酸提取率的影响

Fig.2Effects of ethanol volume fraction on extraction yield of chlorogenic acid from sunflower seeds

图 2乙醇体积分数对葵花籽中绿原酸提取率的影响

Fig.2Effects of ethanol volume fraction on extraction yield of chlorogenic acid from sunflower seeds

2.2超声波微波辅助提取葵花籽绿原酸的单因素试验

2.2.1乙醇体积分数由图2可知，乙醇体积分数在45%～65%时，绿原酸的提取率随着乙醇体积分数的升高而有所增加，在乙醇体积分数为65%时提取率达到最大值；之后随着乙醇体积分数的升高，绿原酸的提取率有下降趋势，可能是因为乙醇体积分数升高会使蛋白质与绿原酸的氢键加强，从而导致提取率下降。单因素试验结果表明，乙醇的最佳体积分数是65%。

2.2.2液料比由图3可知，随着液料比的增加，绿原酸的提取率呈现先升高后保持不变的趋势，在液料比达到25∶1时，提取率达到最大值，液料比继续增加，绿原酸提取率不再变化，故从经济角度出发，最佳液料比选为25∶1。

2.2.3超声波功率由图4可知，当超声波功率为300 W时，绿原酸提取率最大；功率超过300 W后，提取率呈下降趋势，故最佳超声波功率为300 W。

图 3　液(mL)料(g)比对葵花籽中绿原酸提取率的影响Fig.3　Effects of ratio of liquor to material on extraction yield of chlorogenic acid from sunflower seeds图 4　超声波功率对葵花籽中绿原酸提取率的影响

图 4　超声波功率对葵花籽中绿原酸提取率的影响Fig.4　Effects of ultrasonic power on extraction yield of chlorogenic acid from sunflower seeds

2.2.4微波功率由图5可知，绿原酸的提取率随着微波功率的升高呈先增加后降低的趋势。在微波功率达到500 W时，提取率达到最大值，之后逐渐降低。这可能是因为随着微波功率的增加会引起温度升高，绿原酸受热易氧化分解，因而导致提取率降低。故最佳微波功率选为500 W。

2.2.5微波辐射时间由图6可知，当微波辐射时间在30～90 s时，绿原酸提取率不断增加；当微波辐射时间在90～150 s时，提取率呈现下降趋势。因此最佳微波辐射时间为90 s。

图 5　微波功率对葵花籽中绿原酸提取率的影响Fig.5　Effects of microwave power on extraction yield of chlorogenic acid from sunflower seeds

图6　　微波时间对葵花籽中绿原酸提取率的影响Fig.6　Effects of microwave time on extraction yield of chlorogenic acid from sunflower seeds

2.3超声波微波辅助提取葵花籽绿原酸的响应面设计试验

2.3.1响应面试验结果选择液料比(X1)、超声波功率(X2)、微波功率(X3)进行三因素三水平的Box-Behnken的中心组合试验设计，试验结果见表2。

2.3.2回归方程的建立利用Design-expert 8.0对表2试验数据进行回归分析，得到超声波微波辅助提取葵花籽绿原酸得率对液料比、超声波功率、微波功率的二次多项回归方程：

表 2　超声波微波辅助提取葵花籽绿原酸的响应面设计及试验结果Table 2　Design and results of response surface analysis on ultrasonic/microwave-assisted extraction of chlorogenic acid from sunflower seeds

表 3　超声波微波辅助提取葵花籽绿原酸回归方程的方差分析Table 3　Variance analysis on fitted quadratic regression equations in response surface analysis of ultrasonic/microwave-assisted extraction of chlorogenic acid from sunflower seeds

(1)液料比和超声波功率的交互作用。在微波功率为500 W时液料比和超声波功率的等高线图及响应面见图7。由图7可以看出，液料比在20∶1～30∶1、超声波功率在250～350 W时，绿原酸提取率呈现先升高后降低的变化趋势。由等高线图可知，液料比与超声波功率的交互作用不显著。

图 7液(mL)料(g)比与超声波功率交互作用对葵花籽绿原酸提取率的影响

Fig.7Effect of ratio of liquor to material and ultrasonic power on extraction yield of chlorogenic acid from sunflower seeds

(2)液料比和微波功率的交互作用。在超声波功率为300 W时， 液料比和微波功率的等高线图及响应面见图8。由图8可以看出，在液料比为20∶1～30∶1时，绿原酸提取率呈现先增大后减小的趋势；在微波功率为400～500 W时，提取率明显增大，在500～600 W时，提取率变化缓慢，说明液料比对提取率的影响作用大于微波功率。图8的等高线表明，液料比与微波功率的交互作用对提取率有明显影响。

图 8　液(mL)料(g)比和微波功率交互作用对葵花籽绿原酸提取率的影响Fig.8　Effect of ratio of liquor to material and microwave power on extraction yield of chlorogenic acid from sunflower seeds

(3)超声波功率和微波功率的交互作用。在液料比为25∶1时，超声波功率和微波功率的等高线图及响应面见图9。从图9等高线可以看出，超声波功率与微波功率的交互作用对绿原酸提取率影响显著。从响应面的变化趋势看，超声波功率对绿原酸提取率的影响大于微波功率。

2.3.4最佳工艺条件的确定及验证通过Design Expert 8.0 对回归方程进行分析，得到超声波微波辅助提取葵花籽绿原酸的最佳工艺条件为：液料比25.47∶1，超声波功率307.1 W，微波功率539.36 W。在此条件下预测的绿原酸提取率为3.29%。在上述最优条件下进行3次重复验证试验，得到绿原酸的提取率为3.27%，与预测提取率十分接近，表明回归模型可以较好地反应绿原酸提取的最佳条件。

图 9　超声波功率和微波功率交互作用对葵花籽绿原酸提取率的影响Fig.9　Effect of ultrasonic wave power and microwave power on extraction yield of chlorogenic acid from sunflower seeds

3　结　论

本试验将超声波微波辅助法应用到葵花籽绿原酸的提取中，通过单因素试验确定提取葵花籽绿原酸过程中各因素对提取率的影响，采用Box-Behnken响应面法建立二次回归模型方程，对提取条件进行优化，对主要因素及其相互作用进行分析，经过修正得到最佳工艺条件为：液料比25∶1、超声波功率300 W、微波功率540 W。与其他方法相比，超声波微波辅助提取葵花籽绿原酸法反应时间短、提取率高、操作简单，为葵花籽绿原酸的提取提供了理论依据和一定的借鉴作用。

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Optimization of ultrasonic/microwave-assisted extraction of chlorogenic acid from sunflower seeds by response surface methodology

LIU Zhenchun，QIAN Yue

(CollegeofFoodScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun，Jilin130118,China)

【Objective】 Optimum process conditions for extraction of chlorogenic acid from sunflower seed were determined.【Method】 Using ethanol as extraction solvent and extraction yield of chlorogenic acid as index,ultrasonic/microwave-assisted method was used to extract chlorogenic acid from sunflower seed.On the basis of single factor experiments,ratio of liquor to material,ultrasonic power,and wave power were selected as main factors influencing the extraction yield.Then,response surface was used for process optimization,and the extraction yield of chlorogenic acid was analyzed using quadratic regression model.【Result】 Experimental results of single factors showed that the extraction yield of chlorogenic acid increased firstly and remained subsequently with the increase of ratio of liquor to material,while it increased firstly and dropped subsequently with the increase of ethanol volume fraction,ultrasonic power,wave power and microwave time.Optimum conditions of the extraction of chlorogenic acid using response surface method were:ratio of liquor (mL) to material (g) 25.47∶1,ultrasonic power 307.1 W,and microwave power 539.36 W.The revised best process conditions were:ratio of liquor to material 25∶1,ultrasonic power 300 W,microwave power 540 W,ethanol volume fraction 65%,and microwave time 90s,under which the highest extraction yield of chlorogenic acid was 3.27%. 【Conclusion】 The ultrasonic/microwave-assisted extraction method of chlorogenic acid from sunflower seeds had the advantages of simple operation,short time and high extraction yield.

sunflower seeds;chlorogenic acid;ultrasonic;microwave;response surface methodology

时间:2016-09-0709:03DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.10.022

2015-04-19

吉林省科技发展计划项目(2014011)

刘振春(1963-)，男，吉林德惠人，教授，博士，主要从事食品营养与功能性食品研究。E-mail：liuzhenchun63@163.com

TS201.1

A

1671-9387(2016)10-0157-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160907.0903.044.html