大豆品种和混菌发酵对纳豆品质及风味改良效果研究

金 虎，时 杰，关 品，李坤朋，黄凤洪，钮琰星，王改改，陈 洪，周新安

（1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉 430062；2.湖北尝香思食品有限公司，湖北潜江 433121）

大豆品种和混菌发酵对纳豆品质及风味改良效果研究

金 虎1，时 杰1，关 品2，李坤朋1，*黄凤洪1，钮琰星1，王改改1，陈 洪1，周新安1

（1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉 430062；2.湖北尝香思食品有限公司，湖北潜江 433121）

以纳豆激酶活性和游离氨基酸含量为纳豆营养品质评价指标，研究了不同品种大豆对发酵纳豆营养品质的影响，并考察了乳酸菌和纳豆芽孢杆菌混合发酵模式对改善纳豆风味的作用效果。结果表明，不同大豆品种中蛋白含量差异对纳豆品质影响不大，对同一品种大豆而言，种植地域差异对纳豆激酶活性有影响，但对游离氨基酸含量影响不大；乳酸菌和纳豆芽孢杆菌混合菌种发酵能够明显改善纳豆风味，但同时也会降低纳豆中游离氨基酸含量，适宜的乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种体积比范围（1.2∶1～2.0∶1）对纳豆激酶分泌具有促进作用，适合纳豆激酶表达的最佳接种体积比为1.6∶1。

纳豆；纳豆激酶；乳酸菌；风味；混菌发酵

0 引言

纳豆是日本传统的发酵食品，历史悠久，其以大豆为原料，经纳豆芽孢杆菌发酵而成。在纳豆发酵过程中，纳豆芽孢杆菌会产生一种丝氨酸蛋白酶（即纳豆激酶），该酶具有纤溶活性，可以治疗和预防血栓疾病。另外，纳豆还具有抗肿瘤、降血压、抗菌、抗氧化、预防骨质疏松、提高蛋白质的消化率等多种保健功能。纳豆作为一种具有多种保健功能的大豆发酵食品，值得在我国推广，但传统的日本纳豆带有氨臭味，其风味使我国消费者难以接受。

为改善纳豆的风味，许多研究者从工艺优化［1］、辅料添加［2］、混合发酵［3］和菌株改造［4］等方面做了大量的研究工作。该研究以湖北省几个具有代表性的大豆品种为研究对象，对比考察以这几种大豆以及市购东北大豆为原料对发酵纳豆品质的影响。同时，考察了乳酸菌和纳豆芽孢杆菌混合菌种发酵对纳豆品质及风味改良的作用效果，为筛选适合纳豆发酵的优异大豆品种及实现纳豆产品的本土化和工业化提供参考。

1 材料与方法

1.1.1 试验原料

鄂豆8号、早熟8号、鄂豆10号、中豆32、中豆30、天隆1号和天隆2号大豆，由中国农业科学院油料作物研究所周新安研究员提供；东北大豆，于附近市场购买。

1.1.2 菌种

纳豆芽孢杆菌，购自中国工业微生物菌种保藏中心；乳酸菌为本实验室保藏。

1.1.3 培养基

（1）乳酸菌种子培养基。蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20 g，吐温80 1.0 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g，三水醋酸钠5.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 0.05 g，将上述成分加入到1 000 mL蒸馏水中，pH值调节至6.5。

（2）纳豆芽孢杆菌种子培养基。蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.2。

1.2.1 菌种活化和摇瓶种子培养

先将保藏于-80℃冰箱中的纳豆芽孢杆菌和乳酸菌分别转接于LB和MRS斜面培养基上，然后分别放入28℃和37℃恒温培养基中培养24 h，得到活化的菌株。分批挑取活化后的纳豆芽孢杆菌和乳酸菌单菌，落于纳豆芽孢杆菌和乳酸菌种子培养基中进行摇瓶培养，纳豆芽孢杆菌培养温度37℃，搅拌转速200 r/min，培养时间14 h；乳酸菌培养为静置培养，培养温度37℃，培养时间24 h。

1.2.2 纳豆发酵

将一定量不同品种大豆用清水冲洗除杂后，置于3倍量的清水中浸泡14～18 h。将浸泡好的大豆沥水后，于121℃条件下灭菌30 min。待灭菌后的大豆冷却至40℃左右时，将乳酸菌和纳豆芽孢杆菌以不同体积比接种液态种子，搅拌均匀后放入37℃恒温培养箱中培养24 h，将发酵好的纳豆放入4℃冰箱后熟24 h，即得成熟的纳豆。

1.2.3 纳豆激酶活性检测

采用琼脂糖-纤维蛋白平板法，具体方法见参考文献［3］。取5 g纳豆，加5 mL生理盐水搅拌，在低温（4℃）条件下提取1 h，吸取0.5 mL提取液于离心试管中，以转速1 000 r/min于低温（4℃）下离心10 min，取上清液待用。制琼脂糖-纤维蛋白平板时，取1%琼脂糖溶液16.2 mL，在45℃水浴中保温30 min，然后将1.3 mL凝血酶溶液倒入琼脂糖中，混匀后置于45℃水浴中保温5 min的纤维蛋白原溶液16.2 mL，充分混合后立刻倒入培养皿中，室温放置1 h，即得琼脂糖-纤维平板。然后在平板上打直径2 mm的孔，每孔点离心上清液样品10 μL，静置10 min，于37℃恒温条件下培养18 h，测量溶圈大小。以尿激酶为标准曲线，计算纳豆激酶活性。

1.2.4 游离氨基酸含量测定

取一定量混匀的纳豆样品放入研钵中细细研碎成糊状，从中取1 g粉碎的纳豆于烧杯中，用去离子水充分溶解并定容至50 mL，过夜存放。然后，按参考文献［5］方法测定游离氨基酸质量浓度。

1.2.5 拉丝长度的测定及感官评定

见［6］并作适当修改。将纳豆均匀搅拌后用筷子挑起，以10 cm为1个单位，从中间挑起，垂直拉10 cm为2个单位，再从拉起的10 cm中挑起，依次重复进行，直至拉断。记录拉丝的数量。

2 结果与讨论

在相同发酵条件下，比较研究了湖北地区种植的不同大豆品种和市售东北大豆作为原料对发酵纳豆品质的影响。

不同大豆品种对发酵纳豆中纳豆激酶活性和游离氨基酸含量的影响见表1。

表1 不同大豆品种对发酵纳豆中纳豆激酶活性和游离氨基酸含量的影响

由表1可知，湖北省大豆中蛋白含量普遍高于市售东北大豆，其中鄂豆8号大豆中蛋白含量高达48.8%，比市售东北大豆蛋白含量（41.5%）高7.3%；天隆2号大豆中蛋白和脂肪含量与东北大豆接近。纳豆激酶活性和游离氨基酸含量作为评价纳豆营养价值的重要指标，发酵纳豆中纳豆激酶活性和游离氨基酸含量与大豆原料中蛋白含量无明显相关性，中豆32号中蛋白含量较高（47.6%），但纳豆激酶活性最低，每1 g纳豆中纳豆激酶活性仅为183 IU。综合考虑纳豆激酶活性和游离氨基酸含量2种指标，天隆1号大豆为最适合纳豆发酵大豆原料，其纳豆激酶活性和游离氨基酸含量分别高达579 IU/g和300.9 μmol/g。

对同一大豆品种（鄂豆8号）在湖北不同种植地的大豆原料进行了收集，比较了这些大豆作为原料生产发酵纳豆的情况。

同一大豆品种（鄂豆8号）不同种植地对发酵纳豆品质的影响见表2。

表2 同一大豆品种（鄂豆8号）不同种植地对发酵纳豆品质的影响

由表2可知，大豆中蛋白和脂肪含量不仅与大豆品种有关，还与种植地域相关。种植在朱湖村的大豆蛋白含量要普遍高于种植在杨林村的同品种大豆，最高蛋白含量相差5.1%。种植于朱湖村的鄂豆8号大豆作为原料发酵的纳豆中纳豆激酶活性是种植于杨林村大豆所发酵纳豆激酶活性的1.9～2.3倍，明显高于种植于杨林村的大豆。种植地域差异对同一大豆品种发酵纳豆中游离氨基酸含量影响不大，游离氨基酸含量约在300 μmol/g。

在以单一纳豆芽孢杆菌对大豆进行发酵时，发酵后的纳豆具有很明显的氨味。为此，本研究考察混合菌种发酵，即同时接种乳酸菌和纳豆芽孢杆菌对改善纳豆风味的效果。

乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种比例对纳豆发酵品质的影响见表3。

表3 乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种比例对纳豆发酵品质的影响

由表3可知，与单一纳豆芽孢杆菌发酵相比，随着乳酸菌接种比例的逐步增加，发酵纳豆的氨味逐渐减弱，当乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种体积比大于1∶1时，发酵纳豆的氨味消失，且纳豆呈现出特殊的醇香味，表明乳酸菌和纳豆芽孢杆菌混菌发酵可以明显改善纳豆的风味。而且，混合菌种发酵对发酵纳豆的形状和金属光泽没有影响，对纳豆拉丝效果也影响不大。

乳酸菌在改善纳豆风味的同时，是否会对纳豆营养品质尤其是纳豆激酶活性产生影响。为此，考察了乳酸菌和纳豆芽孢杆菌混合菌种发酵及接种比例对纳豆激酶活性的影响。

乳酸菌与纳豆芽孢杆菌接种比例对纳豆激酶活性的影响见图1。

由图1可知，当乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种比例逐渐增加至1时，纳豆激酶活性略有降低（从670 IU/g降至460 IU/g）。当乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种体积比从1∶1增加至1.6∶1时，纳豆激酶活性显著增加；当接种比例为1.6∶1时，纳豆激酶活性高达1 080 IU/g，是单一纳豆芽孢杆菌发酵时活性的1.6倍。但随着接种比例的继续增加，纳豆激酶活性开始逐渐降低，当乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种体积比为3∶1时，纳豆激酶活性降至346 IU/g，约为单一纳豆芽孢杆菌发酵时活性的0.5倍。上述结果表明，适宜的乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种体积比范围（1.2∶1～2.0∶1）对纳豆激酶分泌具有促进作用，适合纳豆激酶表达的最佳接种比例为1.6∶1。

图1 乳酸菌与纳豆芽孢杆菌接种比例对纳豆激酶活性的影响

已有研究表明，纳豆发酵过程中有50%～60%分解成水溶性氮化物，其中游离氨基酸含量占10%［7］。而且，纳豆中游离氨基酸的含量与纳豆风味直接相关，纳豆中游离氨基酸态氮含量的高低可作为纳豆生产工艺和产品品质的关键控制点［8］。

乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种比例对纳豆游离氨基酸含量的影响见图2。

图2 乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种比例对纳豆游离氨基酸含量的影响

由图2可知，随着乳酸菌接种比例的逐渐增加，纳豆中游离氨基酸含量逐渐下降，当乳酸菌和纳豆芽孢杆菌的接种体积比为1∶1时，游离氨基酸质量浓度约下降至单一纳豆芽孢杆菌发酵时的50%，表明乳酸菌的添加弱化了大豆蛋白的分解速度。

3 结论

比较研究了湖北地区不同品种大豆和不同种植地同一品种大豆作为纳豆发酵原料对纳豆品质的影响。结果表明，天隆1号大豆为最适合纳豆发酵大豆原料，其纳豆激酶活性和游离氨基酸含量分别高达579 IU/g和300.9 μmol/g；种植在朱湖村的鄂豆8号大豆蛋白含量要普遍高于种植在杨林村的鄂豆8号大豆，最高蛋白含量相差5.1%；种植地域差异对同一大豆品种发酵纳豆中游离氨基酸含量影响不大，游离氨基酸含量约在300 μmol/g；乳酸菌和纳豆芽孢杆菌混合菌种发酵能够明显改善纳豆风味，适宜的乳酸菌和纳豆芽孢杆菌接种体积比范围（1.2∶1～2.0∶1）对纳豆激酶分泌具有促进作用，适合纳豆激酶表达的最佳接种体积比为1.6∶1。

［1］ 关茵，肖然，李春.从工艺角度改善纳豆风味的研究 ［J］.中国酿造，2010（6）：75-77.

［2］ 陈文珊，关茵，肖然，等.辅料对纳豆风味影响的研究 ［J］.中国调味品，2011（1）：55-57.

［3］ 黄占旺，上官新晨，程军辉，等.纳豆混合发酵技术研究 ［J］.中国食品学报，2005（4）：70-73.

［4］ 黄蓓，吴旭蕾，钱炳俊，等.纳豆芽孢杆菌rocG基因和ure基因敲除载体的构建 ［J］.上海交通大学学报（农业科学版），2013（5）：16-19.

［5］Lie S.The EBC-ninhydrin method for determination of free alpha amino nitrogen［J］.Journal of the Institute of Brewing，1973，79（1）：37-41.

［6］ 奚锐华，齐凤兰，陈有容.纳豆生产工艺的优化 ［J］.食品工业科技，2004（3）：78-80.

［7］ 李麒.纳豆的营养与保健价值 ［J］.中国食物与营养，2002（1）：48-49.

［8］ 王冬燕，王远红，郭丽萍，等.纳豆中氨基酸态氮含量的测定 ［J］.食品工业科技，2010（9）：361-362.◇

The influences of soybean varieties on natto quality and mixed fermentation of Lactobacillus and Bacillus natto on natto flavor improvement are investigated based on the nutritional evaluation indexes of nattokinase activities and free amino acids content.The results indicate that natto quality is not influenced by the difference of protein contents in different soybean varieties.For the same soybean varieties，the difference of planting areas would influence the nattokinase activities but not the concentration of free amino acids.Mixed fermentation of Lactobacillus and Bacillus natto could improve the natto flavor significantly，but the concentration of free amino acids will be decreased correspondingly.A suitable ratio of Lactobacillus and Bacillus natto ranging from 1.2∶1～2.0∶1 can promote the secretion of nattokinase and the optimal ratio of Lactobacillus and Bacillus natto is 1.6∶1.

nattto；nattokinase；Lactobacillus；flavor；mixed fermentation

1671-9646（2016）09a-0004-04

TS214

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.09.002

2016-07-08

湖北省重大科技创新计划项目（2014ABBOB）。

金 虎 （1980— ），男，博士，助理研究员，研究方向为油料饼粕的生物转化与高值化利用。

黄凤洪（1965— ），男，博士，研究员，研究方向为油料加工。