天冬氨酸激酶代谢调控的研究进展

杨宇亭，闵伟红

（吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林 长春 130118）

天冬氨酸激酶代谢调控的研究进展

杨宇亭，闵伟红*

（吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林 长春 130118）

在微生物发酵合成天冬氨酸族氨基酸的代谢途径中，天冬氨酸激酶（aspartokinase，AK）是限制碳源和氮源流速的限速酶，是决定能否获得高产天冬氨酸族氨基酸的关键之一。本文介绍了AK的重要性、不同来源AK的整体结构、效应结合位点的特点和调控机制研究进展，并对AK代谢调控的发展做出展望，为进一步明确AK代谢调控机制，促进天冬氨酸族氨基酸产业化发展提供参考和依据。

天冬氨酸激酶；合成途径；效应结合位点；调控机制

氨基酸是含氮化合物和蛋白质中关键的化学成分，它们的代谢是植物、微生物生长和发育的基础[1]。对氨基酸和氮代谢机理的研究能够提高我们对于植物、微生物中代谢途径方面的理解[2]。氨基酸生物合成途径在植物和微生物体内普遍存在（图1）。其中，天冬氨酸家族的氨基酸合成途径中，可合成4 种必需氨基酸：异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸[3]。这4 种必需氨基酸在动物饲料和人类食物中极具营养价值[4]。氨基酸代谢途径是由大量的关键酶和中间体参与形成的一个复杂的调控网络[5]。其中一些关键酶如天冬氨酸激酶（aspartokinase，AK，EC2.7.2.4）、高丝氨酸脱氢酶（homoserine dehydrogenase，HSDH，EC1.1.1.3）、二氢吡啶二羧酸合成酶（EC4.1.2.52）和苏氨酸合成酶（EC4.2.99.2）已在植物、微生物中得到分离、纯化和表征[6]。这几种酶大多数已被证明是许多基因调控的同工酶形式[7-8]。在这些酶当中，AK是在结构和变构性质方面最具代表性的同工酶。

图1 天冬氨酸族氨基酸生物合成途径[9]Fig.1 Biosynthesis pathway of aspartic acid family amino acids[9]

1 AK在天冬氨酸族氨基酸合成途径中的作用

由于天冬氨酸族氨基酸合成途径在人体内不存在，因此人和哺乳动物只能通过饮食获取异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸4 种必需氨基酸。所以通过一定手段达到植物和微生物中必需氨基酸高产具有重大意义。AK是天冬氨酸族氨基酸合成途径中第一个关键酶，并在该合成途径中起到至关重要的作用。虽然在不同种生物体，AK以不同形式存在，但其在天冬氨酸族氨基酸合成途径中，都将三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的磷酸基团转移到天冬氨酸上，使天冬氨酸磷酸化合成天冬氨酸β半醛。在合成终产物时，AK会受到终产物的反馈抑制控制。因此，解除终产物对AK的反馈抑制，有助于提高AK的活性，使整个通路更加顺畅，提高必需氨基酸的产量。

AK在植物、微生物代谢合成途径中普遍存在。在詹氏甲烷球菌中，以天冬氨酸为底物的代谢途径中，AK是以只对苏氨酸敏感的同工酶形式存在[10]。在一些细菌中，如谷氨酸棒杆菌和集胞藻，这两种菌种中AK在合成途径中都以对苏氨酸（Thr）和赖氨酸（Lys）敏感的形式存在。在大肠杆菌和拟南芥中，AK致力于苏氨酸、赖氨酸和蛋氨酸的合成[11-12]。然而，变构酶的调控网络二者之间是完全不同。在大肠杆菌中，一个赖氨酸敏感的单官能团的AK（AKIII）[13]和苏氨酸敏感的双功能团AK-HSDH I参与变构控制。拟南芥中存在3 种单官能团形式AK（AK1、AK2 和AK3），还有两个双功能团AKHSDH（I、II）[14]。

2 AK结构分类

通过对不同生物体中AK结构和生化特性研究表明，无论AK变构调节的多样性还是协同反馈作用，都与其分子结构有重要关系。AK晶体结构的分类方法有两种。

第一种分类方法根据亚基数量分为三类[15]（表1）。第一类（I类型）包含同源二聚体酶和同源四聚体酶，它们都含有一个催化结构域和两个ACT结构域（图2a、b）。Kotaka等[16]描述了大肠杆菌Escherichia coli AKIII两种状态下的晶体结构。一是不活跃的带有反馈抑制剂赖氨酸的T状态。二是结合天冬氨酸和腺苷二磷酸（adenosine diphospate，ADP）的R状态。并分析了其中起到重要作用的ACT结构域。在2014年，Manjasetty等[17]对丙酮丁醇梭菌天门冬氨酸激酶的晶体结构中结合位点、催化和调控机理进行分析，发现该AK是一种重要的变构酶，并对医药方面研究有重要作用。第二类（II类型）是α2β2型异四聚体酶，其每个α亚基内有一个催化结构域和两个ACT结构域，每个β亚基含有两个ACT结构域。Kato等[18]为了阐明AK的反馈抑制调控机制，通过同源建模的方法构建了一种新型的AK，它是以具有α2β2型四聚体结构的枯草芽孢杆菌AKII和黄栖热菌AK为模型构建的。Yoshida等[19]确定了谷氨酸棒杆菌AK（Corynebacterium glutamicum，AKcg）的3 种形式：一种是与赖氨酸和苏氨酸抑制络合形式；一种是仅与苏氨酸复合的活性形式；一种是与两个赖氨酸和一个苏氨酸反馈抑制抗性突变体（S301F）复合形式。AKcg就是典型的第二类AK，其中α和β亚基都含有ACT1-ACT2结构域。与第一类AK不同的是，每个α亚基上的ACT1与β亚基上的ACT2相互作用，形成8 段折叠和4 段螺旋[20]。第三类（III类型）是同源二聚体酶，结构代表是集胞藻（Synechocystis AK，AKsy）[21]。与第一类不同的是，其每个亚基含有一个催化结构域和4 个ACT结构域。Yoshida等[22]确定了嗜热菌中AK苏氨酸调节亚基的晶体结构，在缺少苏氨酸的情况下，嗜热菌比其他菌种更具热稳定性。由于大肠杆菌天冬氨酸激酶（Escherichia coli AK，AKec）和詹氏甲烷球菌天冬氨酸激酶（Methanococcus jannaschii AK，AKmj）的四聚化使催化区域间催化能力比AKcg和AKsy催化区域催化能力减弱[23-24]。

第二种分类方法将AK根据亚基同源性分为AKα和AKβ两类（表1）。Robin等[21]对蓝藻中AK晶体结构AKβ具体分析，证明其是一种新型的二聚体结构。AKα与AKβ有显著区别。显着差异为AKβ催化结构域的N-末端序缺少约60 个氨基酸残基的两个螺旋。由于缺少这段氨基酸序列，使AKβ亚基催化结构域的α2和α3螺旋间相互作用形成二聚体结构。

图2 3 种类型AK晶体结构Fig.2 Crystal structures of three classes of AK

表1 不同菌种中天冬氨酸激酶的数量、分类及晶体结构Table 1 Classification， domain organization and number of AKs

3 效应结合位点的形成及特点

AK的变构效应是由包含2 个或4 个ACT的调控域所形成。ACT结构域是调控域最关键的结构。该结构最初发现存在于3 种变构酶（AK（A）、分支酸变位酶（C）和预本酸脱氢酶（T））中[25]。

I类型AK的变构效应结合位点由相同ACT结构域之间的相互作用产生，并且能结合两种相同的氨基酸。AKat和AKec的晶体结构显示，两个ACT1相互作用产生两个等效的赖氨酸结合位点[26]。而在AKmj中，两个ACT2的相互作用产生两个相等的苏氨酸结合位点[27]。因此，AKI只有两个ACT域在氨基酸结合时有功效，另外两个只能起到结构作用。

II类型AK是通过使两个不同氨基酸结合不同的ACT域之间的相互作用产生的结合位点[28]。在AKcg中，每个ACT1结合β亚基产生一个赖氨酸结合位点，ACT2与α亚基相结合产生苏氨酸结合位点。然而，每一个α亚基与ACT1结合或者β亚基与ACT2相结合仅生成一个苏氨酸结合位点。在这种情况下，赖氨酸结合位点是空置的。

III类型AK是两个不同的ACT域（ACT1与ACT4和ACT2与ACT3）的相互作用在效应结合口袋处产生两个非等价的结合位点。

4 AK的调控机制

无论是在植物、微生物中天冬氨酸激酶都具有复杂的变构调控机制[28]。例如，在植物拟南芥中有5 种AK，其中3 个是受赖氨酸和S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）反馈抑制的单官能团AK，另外两个AK是结合有HSDH双官能团并受由苏氨酸和亮氨酸的反馈抑制[29]。在大肠杆菌中含有3 个AK同工酶，其中2 种属于双官能AK，另一种属于单官能团AK。然而，只有其中的两个涉及变构控制。在枯草芽孢杆菌也发现3 种二聚体AK[30]。詹氏甲烷球菌和嗜热菌仅包含一个AK且能合成苏氨酸[31]，而在集胞藻属和谷氨酸棒杆菌的途径导致两个苏氨酸和赖氨酸的合成[32]。

在结构上看天冬氨酸激酶具有复杂的调控机制，AK是一个四聚体，由两个α亚基和两个β亚基构成，形成α2β2四聚体结构，并且由等物质的量的α和β亚基组成。α亚基包含两个结构域，即N末端的催化结构域和C末端的调控结构域。β亚基与α亚基的调控结构域相同，由两个ACT结构域基序组成，ACT结构域是天冬氨酸激酶的别构剂结合位点，ACT结构域含有两个苏氨酸结合位点，一个赖氨酸结合位点。α亚基与AK的催化活性和调控功能有关，而β亚基对AK的稳定性起重要作用。

最近，有研究对不同类型的AK（单官能团或双官能团）和它们的亲缘关系的进化进行了描述[17]。棒杆菌AK变构调节过程中，不仅涉及下游代谢产物中的天冬氨酸衍生的氨基酸，其中，一些天冬氨酸激酶衍化的次级代谢产物为氨基酸的合成提供了前体。这表明，在氨基酸生物合成途径中天冬氨酸激酶是用于平衡不同植物的相对通量的一个重要的检查点。

5 编码AK的基因克隆

Shaul等[33]首次通过转基因手段，使两种烟草植物产生脱敏的AK，并在大肠杆菌中表达，发现两种转基因植物苏氨酸产量过剩。实现了通过潜在的基因工程手段增加氨基酸在植物体内的积累。Ferreira等[34]从不成熟的种子中纯化得到AK和HSDH，并证明了这两种酶在种子中被苏氨酸和赖氨酸协同抑制。Curien等[35]对AKat进一步划分，发现拟南芥单官能团AK基因组包含3 个基因。其中AK2和AK3仅由赖氨酸抑制，而AK1由赖氨酸和SAM协同抑制。同时还分析了3 种AK基因分别与抑制剂的抑制机制。

6 AK的定点突变及酶抑制机制

定点突变技术是在传统聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术的基础上，利用软件分析酶的三维晶体结构，并针对酶的关键位点设计引物，在DNA扩增的过程中通过改变其组成和顺序，以便达到对酶的氨基酸序列改造的目的。定点突变技术的应用与发展为AK抑制机制的研究开辟了道路。定点突变技术不仅可以改变基因序列中特定的核苷酸，还可以对氨基酸代谢中酶功能区域的基因序列进行定点突变，从而产生一系列突变子。

Bareich等[36]首次利用定点突变技术手段，分析了酿酒酵母中天冬氨酸激酶基因序列中的几种保守残基参与酶促反应的重要作用，尤其K18和H292对于研究天冬氨酸激酶活性有重要意义。2003年Marco-Marín等[37]对大肠杆菌中AKIII的关键氨基酸残基进行定点突变，通过三维建模分析了C末端结构域是结合赖氨酸并对其调控的关键区域。

2006年Yoshida等[38]利用定点突变等技术分析了嗜热菌（Thermus thermophilus）中AK与苏氨酸反馈抑制机制。并在苏氨酸存在的情况下进行结晶。Chen Zhen等[32]综合分子动力学和协同进化对天冬氨酸激酶的变构抑制进行分析为氨基酸生产做出可靠指标预测。Malothu等[39]携带天冬氨酸激酶基因的质粒PBR322在谷氨酸棒杆菌中表达，发酵96 h后，赖氨酸产量达到3.5 mg/mL，比普通菌种发酵提高了0.6 mg/mL。

近几年吉林农业大学食品科学与工程学院发酵工程实验室通过定点突变技术和高通量筛选等生物信息学手段对北京棒杆菌天冬氨酸激酶进行深入研究。通过对三维晶体结构分析了与Lys、Thr抑制剂附近的关键残基，选定了8 个位点进行饱和定点突变，获得高活力突变株25 株（表2）。其中，任军[40]对北京棒杆菌AK高活力突变体菌株G359K和V360N进行详细酶学性质表征，并证明解除了Lys对AK的抑制作用。李慧颖[9]对北京棒杆菌AK中D274进行饱和突变，并对突变体进行酶学性质表征，其中D274Y被证明解除Thr对AK的抑制作用。2014年，郭永玲[41]对北京棒杆AK的T361位点和A362进行饱和定点突变，并对突变株进行高通量筛选，得到酶活力高的突变株，其中T361N、A362I解除了Lys抑制作用，并且酶活力分别提高47.99 倍和34.6 倍。2014年，朱运明等[42]对北京棒杆菌AK的Gly377位点进行突变，并筛选获得高活力突变体G377F，并对突变体进行酶学性质进行表征，其解除Lys抑制作用，酶活力提高17.05 倍。李慧颖等[43]成功构建AK突变体R169H。该突变体是受Lys和Thr反馈抑制调节，经分析突变体中R169与E92间氢键消失，能够影响亚基间聚合度，减弱代谢产物对AK的反馈抑制作用，从而使R169H中AK的酶活力提高4.71 倍。

表2 关于北京棒杆菌AK高活力突变株及解除抑制剂抑制作用的报道Table 2 Reports on mutation of Corynebacterium pekinense for high AK activity and inactivation of AK inhibitors

7 结 语

AK具有多样性，并且都具有变构调节的特点，这一特点对提高必需氨基酸代谢生产具有重要的意义。目前苏氨酸、赖氨酸已经工业化生产，而甲硫氨酸的生产还没有产业化。因此，在植物和微生物中，天冬氨酸激酶复杂的调控机制的研究对于分析天冬氨酸族氨基酸代谢途径以达到必需氨基酸的高产有举足轻重的作用[44]。

在不同种天冬氨酸激酶中，不同组织的ACT结构域之间的相互作用影响着AK中催化结构域和调节结构域的功能[46]。这就可以解释为什么初始结构导致酶的抑制作用不同。因此，通过改变酶的构象解除抑制剂对酶的抑制作用是势在必行的。在后基因组时代，通过将高通量筛选、定点突变等新型分子生物学技术和蛋白质工程新型理论设计应用到氨基酸生产途径中，改造发酵途径从而提高氨基酸产量。对某个己知基因特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系。这种技术和理论已经在实验室有了系统的实验和成果。生物学技术已经取得了很大的进步，在氨基酸生产菌种改良上也有了一些应用。但它的深入发展还需要能充分整合各组学信息的新方法和更准确分析模拟代谢和调控网络的新算法[47]。

吉林农业大学食品科学与工程学院发酵工程实验室根据生物学信息基础和定点突变及其高通量筛选等技术，对北京棒杆菌AK进行异源表达、纯化、酶学性质的研究，多方位分析其抑制剂附近调控位点的抑制机制对酶活性的影响。AK的调控是复杂的，具有庞大的调控网络，其中不仅有直接调控的位点，远程调控位点也有着重要的作用。因此将继续进行远程调控位点的突变，对AK与抑制剂的抑制机制进一步研究。对AK的研究除了研究基因的结构与功能关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病病因和机理。

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Review of Research on Metabolic Regulation of Aspartokinase

YANG Yuting, MIN Weihong*
(National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Aspartate kinase (aspartokinase, AK) is a rate-limiting enzyme controlling the carbon and nitrogen flux into the biosynthesis pathways of amino acids of the aspartic acid family in microorganisms. It is a key enzyme to determine the ability to obtain aromatic aspartic amino acids. This article describes recent progress in understanding the importance of aspartatekinase, the general structure of aspartatekinases from different species, features of their binding sites and their regulatory mechanisms. Moreover, future research trends in this area are foreseen. The aim of this review is to provide further understanding of the mechanism of metabolic regulation of aspartatekinase and accordingly promote the industrial development of aspartic acid family amino acids.

aspartatekinase; biosynthetic pathway; binding sites; regulatory mechanisms

10.7506/spkx1002-6630-201607048

Q71

A

1002-6630（2016）07-0270-06

杨宇亭, 闵伟红. 天冬氨酸激酶代谢调控的研究进展[J]. 食品科学, 2016, 37(7): 270-275. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607048. http://www.spkx.net.cn

YANG Yuting, MIN Weihong. Review of research on metabolic regulation of aspartokinase[J]. Food Science, 2016, 37(7): 270-275. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607048. http://www.spkx.net.cn

2015-07-24

吉林省自然科学基金项目（20130101139JC）

杨宇亭（1991—），女，硕士研究生，研究方向为发酵微生物的选育与代谢调控。E-mail：15948022712@163.com

*通信作者：闵伟红（1971—），女，教授，博士，研究方向为发酵工程、粮食科学与深加工技术。E-mail：minwh2000@163.com