中温乳化香肠中一株优势腐败菌的分离鉴定与生物学特性

潘晓倩，赵 燕，张顺亮，赵 冰，乔晓玲，陈文华，李家鹏，曲 超

（中国肉类食品综合研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）

中温乳化香肠中一株优势腐败菌的分离鉴定与生物学特性

潘晓倩，赵 燕*，张顺亮，赵 冰，乔晓玲，陈文华，李家鹏，曲 超

（中国肉类食品综合研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）

以中温乳化香肠为研究对象，对其在25 ℃贮藏过程中的优势腐败菌进行分离鉴定，并通过管碟法和酶标比浊法测定肉制品中常用的7 种防腐剂对腐败菌的抑制效果。结果表明，中温乳化香肠在25 ℃贮藏第25天时，菌落总数已超过GB 2726—2005《熟肉制品卫生标准》中规定的菌落数，从该腐败样品中分离得到1 株优势腐败菌CMRC BC-1，根据形态学、生理生化特征和16S rDNA序列比对结果，该菌株被鉴定为凝结芽孢杆菌。7 种防腐剂中，乳酸链球菌素（Nisin）对该菌株具有明显的抑菌活性，添加量为0.1 g/L时，其抑制率达到99.05%；其余6 种防腐剂除山梨酸钾外，在各自的最大添加量时对该菌株均具有一定的抑制作用。

中温杀菌；乳化肠；腐败菌；分离鉴定；特性

中温肉制品是指经过90～110 ℃杀菌，同时给予合适的压力，结合综合抑菌和品质控制技术生产的产品[1]。中温肉制品既避免了高温杀菌引起的产品营养、风味和口感的较大损失，又能够常温流通及贮存，克服了低温肉制品需全程冷链，销售半径小，流通成本高的缺点，大大满足了消费者对高品质肉制品的需求[1]。随着传统高温肉制品进入衰退期，中温肉制品将成为市场新的趋势和增长点。然而中温肉制品虽经过一定程度热处理，杀灭了大部分细菌的营养体，但并不能完全杀灭细菌芽孢和真菌孢子等小部分极耐热微生物[2]。在室温25 ℃贮藏条件下，中温杀菌工艺后能够存活的微生物中，那些适于生存和繁殖并产生相关代谢产物的微生物仍将导致产品腐败变质[3-4]。

一般情况下，产品的初始污染菌只有部分参与后期的腐败过程[5]，也称特定腐败菌（specific spoilage organism，SSO）。SSO的增殖生长很大程度上主导了食品的腐败变质，且不同产品中SSO也有所差异，可能是一种，也可能是几种微生物[6]。近年来，国内外有许多将SSO引入肉及肉制品腐败机理的相关研究，尤其是对低温熟肉制品，众多研究发现乳酸菌是真空包装熟肉制品的主要腐败微生物[7-8]。熏煮香肠是一类重要的低温熟肉制品，目前，关于蒸煮香肠腐败微生物的研究有很多，主要包括乳杆菌属[9-10]、明串珠菌属[11]、芽孢杆菌属[12]等。

本实验以市场占有率较高的中温乳化香肠为研究对象，分析其贮藏期间微生物菌相变化并从腐败样品中分离优势菌，应用生理生化方法结合16S rDNA扩增进行鉴定，研究其生长产酸等生物学特性，并进一步探讨肉制品中常用防腐剂对其生长繁殖的抑制效果，以期为生产过程提供有效控制腐败微生物的措施，延长中温乳化香肠常温货架期，也为其他中温肉制品的保鲜技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基与试剂

乳化香肠加工用原料肉 北京市第五肉类联合加工厂；辅料：食盐、白砂糖、香辛料、大豆蛋白、玉米淀粉等 中国肉类食品综合研究中心香辛料部。

平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、MRS培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar，VRBA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（含抗生素）（potato dextrose agar，PDA）、营养肉汤（nutrient broth，NB）、MRS肉汤 北京陆桥技术有限责任公司。

山梨酸钾、脱氢乙酸钠 南通奥凯生物技术开发有限公司；双乙酸钠 连云港信仁食品添加剂有限公司；葡萄糖酸-δ-内酯 安徽省兴宙医药食品有限公司；亚硝酸钠、乳酸钠、乳酸链球菌素（Nisin） 北京迪朗生化科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、2hTaq PCR MasterMix 北京天根生化科技有限公司；DNA Marker、溶菌酶 北京全式金公司；通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）由美国英杰生命技术有限公司合成。

1.2 仪器与设备

WH82绞肉机、K20 Ras V型斩拌机 德国赛德曼机械制造公司；OSCAR 20真空灌肠机 德国海因里希弗雷机械制造有限公司；杀菌釜 诸城中泰机械有限公司；EN2257电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；F1-45型恒温培养箱、G154DWS湿热灭菌锅 日本三洋公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；PB-10型数显酸度计 赛多利斯科学仪器有限公司；SCIENTZ-11L型无菌均质器 宁波新芝生物科技股份有限公司；T100 Thermal Cycler PCR仪、Gel Doc™ XR+凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；DYCP-31DN型电泳仪 北京市六一仪器厂；VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪及配套BCL鉴定卡片 北京威泰科生物技术有限公司；Synergy H4型酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中温乳化香肠加工工艺

原料肉→解冻→修整→绞肉→斩拌（过程中分步加入香辛料、辅料和脂肪）→灌肠→干燥→蒸煮→冷却→真空包装→中温杀菌→成品

1.3.2 pH值测定[13]

从每根香肠不同部位随机取若干小块混合，均质，利用pH计测定样品pH值，待测样品设5 组平行。

1.3.3 样品贮藏过程中的菌相分析[14]

用灭过菌的剪刀随机从香肠不同部位取样25 g，剪碎，放入无菌均质袋中，并加入225 mL无菌生理盐水于无菌均质器中拍打均质，梯度稀释后，采用选择性培养基对中温乳化香肠贮藏过程中的细菌总数、乳酸菌、肠杆菌科和霉菌进行平板计数，每个实验做3 个重复。具体培养基使用和条件如表1所示。

表1 中温乳化香肠菌相分析的培养基和培养条件Table 1 Selective media and incubation conditions used for bacterial isolation from medium-temperature emulsified sausages

1.3.4 菌株纯培养

观察并记录贮藏过程中不同培养基上微生物的菌落形态，用无菌接种环挑取主要腐败菌菌落，连续进行3 次划线纯化，分离得到的纯菌株进行革兰氏染色观察菌体形态和纯度。挑取平板上的单菌落接种于营养肉汤培养基中，37 ℃、150 r/min摇床培养18～24 h，获得浓度为108～109CFU/mL的菌悬液与质量浓度为30 g/100 mL的甘油按照1∶1的体积比添加至1.8 mL冻存管中，漩涡振荡后于－20 ℃冰箱保存，以便后续实验。

1.3.5 主要腐败菌的菌种鉴定

1.3.5.1 生理生化鉴定

挑取平板上纯菌落，制备1.8～2.2麦氏单位浓度的菌悬液，用VITEK 2 Compact及其配套BCL鉴定卡进行鉴定。

1.3.5.2 分子生物学鉴定

细菌基因组DNA的提取：应用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA，提取产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小和提取质量。16S rDNA基因序列扩增：采用通用引物27F和1492R，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增体系：2hTaq PCR MasterMix 25 μL，DNA模板 2 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，ddH2O 21 μL；PCR扩增的反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，33 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经凝胶电泳检测片段大小正确后，送至立菲生物技术有限公司（北京）进行测序，测序结果与GenBank基因数据库中16S rDNA序列进行同源性比较分析，并利用MEGA 5软件构建系统发育树。

1.3.6 生长曲线及产酸规律测定

取活化好的浓度为108～109CFU/mL的新鲜菌液按2%的接种量转接至新鲜MRS肉汤培养基中，于37 ℃、200 r/min振荡培养，前24 h每隔2 h取样，24 h以后分别在30、36 h和48 h取样，分别以倾注平板法和光电比浊法（OD600nm）测定活菌数和菌悬液浊度；同时用pH计测定菌悬液pH值变化，每个时间点做3 个重复。

1.3.7 防腐剂对主要腐败菌的抑制实验

防腐剂制备方法：根据需要配制的质量浓度，称取一定质量的7 种防腐剂（精确到0.001），加无菌水充分溶解，使用前，以0.45 μm无菌滤膜过滤除菌。以GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》[15]中规定的不同防腐剂在肉制品中使用的最高限量为最大添加质量浓度，依次递减设置5 个质量浓度梯度，每个梯度对应质量浓度如表2所示。

表2 防腐剂质量浓度梯度对照表Table 2 Concentration gradients of 7 preservatives g/L

管碟法：参照李伟丽等[16]的方法，略作修改。MRS培养基121 ℃、15 min高压灭菌后倒板，每板15 mL作为下层，待凝固后，再在每100 mL冷却至45 ℃的上述培养基中添加2 mL浓度为108～109CFU/mL的菌悬液中并混合均匀，加5 mL到已经凝固的培养基上作为上层。以无菌操作在培养基表面垂直放置牛津杯，分别加入表2中5号对应的不同质量浓度防腐剂溶液200 µL，以无菌生理盐水为对照。每组3 个平板，37 ℃培养24 h后观察其抑菌圈大小和透明度，取平均值。

酶标比浊法：参照李峦峰等[17]的方法，略作修改。取4 支灭菌10 mL离心管，编号1～4，分别加入4.4 mL无菌MRS肉汤和0.1 mL浓度为107～108CFU/mL的菌悬液，根据不同防腐剂的终质量浓度对照（表2），3、4号管各加入质量浓度10 倍于体系终质量浓度的防腐剂0.5 mL，1、2号管中加入0.5 mL无菌生理盐水作为对照。1、3号管置于4 ℃冰箱保存，用于OD600nm值测定调零，2、4号管置于37 ℃、200 r/min振荡培养24 h后测定各管菌液OD600nm值，每组3 个平行，抑菌率计算公式如下。

2 结果与分析

2.1 微生物数量及pH值变化情况

表3 25 ℃贮藏过程中微生物及pH值变化Table 3 Changes in bacterial populations and pH during storage at 25 ℃

由表3可知，整个贮藏期间在VRBA和PDA培养基上均未分离到菌，可能是由于中温杀菌过程中所有肠杆菌科细菌已被杀灭，同时由于产品采用真空包装，处于低氧条件，抑制了霉菌等需氧微生物的生长繁殖[18]。贮藏前10 d内在PCA和MRSA培养基上未分离到菌，可能是因为中温杀菌工艺后，产品中残存的微生物极少，且这些微生物受到一定程度热损伤，在贮藏前期进行自我调整和修复，因此生长繁殖处于停滞或极缓慢状态，表现为菌落总数和乳酸菌未检出。贮藏后期，微生物经过自我修复，那些适应新环境的细菌开始生长繁殖，导致菌落总数及乳酸菌数不断增加，在贮藏第25天时，产品中的细菌总数和乳酸菌数分别达到4.78（lg（CFU/mL））和4.77（lg（CFU/mL）），超过了GB 2726—2005《熟肉制品卫生标准》[19]中规定的菌落总数≤5h104CFU/g的要求。

产品pH值在整个贮藏期间呈下降趋势，由第0天的6.47（lg（CFU/mL））下降至第25天的6.17（lg（CFU/mL）），且前期变化较平缓，后期下降相对较快，这与微生物变化趋势相符，主要是因为贮藏前期少数存活下来的微生物生长能力还未得到恢复，分解糖类物质，产生乳酸、醋酸等有机酸的能力较弱，贮藏后期微生物繁殖较快，发酵产酸能力增强，导致pH值下降较快。

2.2 优势腐败菌形态学及生理生化鉴定

将贮藏第25天PCA及MRS培养基上形成的主要腐败菌菌落多次划线纯化，挑取单菌落观察其菌落形态，革兰氏染色后观察其个体形态特征。两种培养基上共划线纯化到6 株菌，依次命名为CMRC BC-1～CMRC BC-6。由图1观察发现，这6 株菌菌落及菌株形态相似，主要表现为：PCA及MRS培养基上生长较好，24 h后形成直径1～2 mm大小的圆形菌落，乳白色，表面湿润平坦、有光泽；革兰氏染色呈阳性，细胞杆状，单个、成对或链状排列，芽孢端生，接触酶阳性，初步判断为芽孢杆菌属，选取BCL鉴定卡进行生理生化鉴定。

图1 CMRC BC-1的菌落形态（A）和革兰氏染色图（B）Fig.1 Colony （A） and Gram staining （B） of strain CMRC BC-1

经VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪鉴定（表4），确定这6 株菌均为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），且各个生理生化反应结果相同，可信度均达到98%，置信水平极好。初步判断中温乳化香肠的特定腐败菌主要是一种。因此选取CMRC BC-1为代表进行后续实验。

表4 菌株CMRC BC-1的生理生化鉴定结果Table 4 Identification results of strain CMRC BC-1 by BCL card

2.3 分子生物学鉴定与系统发育树构建

经测序，CMRC BC-1菌株16S rDNA基因片段大小为1 452 bp。将测序结果登陆国家国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）网站进行比对，并利用MEGA5.0软件与同属亲缘关系较近的模式菌株进行同源性分析，绘制系统发育树，以描述CMRC BC-1的进化地位及与其他芽孢杆菌属内种的相关关系，结果如图2。一般认为，同源性大于99%则属于同一种[20]，经BLAST同源性比较后，菌株CMRC BC-1与凝结芽孢杆菌亲缘关系最近，同源性达到100%，从而确定该菌株为凝结芽孢杆菌。凝结芽孢杆菌最初在1915年由Hammer从酸败的牛奶罐头中分离得到，被表述为一个新种[21]，以后又从其他一些腐败的保存食品中分离出来[22]，通常这种菌能产生高质量浓度的L-乳酸，引起含碳水化合物的罐头食品酸败[23]，如桶装胀罐番茄酱[24]、腐败醋[16]和桃罐头[25]中均分离得到包括凝结芽孢杆菌在内的腐败微生物。凝结芽孢杆菌是乳酸菌的一种，而乳酸菌具有微需氧的特性，在加工环境中普遍存在[26]，通常是真空包装肉类制品中的优势腐败菌[27]。

图2 基于16S rDNA序列同源性的菌株CMRC BC-1的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain CMRC BC-1

2.4 菌株的生长产酸特性

如图3所示，将菌株CMRC BC-1在MRS肉汤上培养，表现出典型的细菌生长规律，从光密度曲线和活菌数曲线上可以看出，0～2 h内为延滞期，时间较短；2～12 h内为对数生长期，此阶段OD600nm值由0.175增加至1.413，活菌数由7.53（lg（CFU/mL））增加至8.73 （lg（CFU/mL））；12～22 h内是稳定期，之后为衰亡期。由pH值变化曲线可以发现，菌株CMRC BC-1生长过程中产酸，其中主要是对数生长期产酸较多，24 h内pH值由5.90下降至4.55。

图3 菌株CMRC BC-1在MRS培养基中的生长曲线和产酸能力Fig.3 Growth curve and acid-producing capacity of strain CMRC BC-1

2.5 管碟法检测防腐剂对指示菌的抑制作用

图4 管碟法测定防腐剂对菌株CMRC BC-1的抑制作用Fig.4 Bactericidal effect of preservatives on strain CMRC BC-1 using cylinder-plate method

图4中0号代表生理盐水对照，1～7号代表肉制品中常用的7 种防腐剂，其名称及质量浓度依次为Nisin 0.5 g/L、双乙酸钠 3 g/L、山梨酸钾 1.5 g/L、葡萄糖酸-δ-内酯 2.0 g/L、亚硝酸钠 0.15 g/L、乳酸钠 2.5 g/L、脱氢乙酸钠 0.5 g/L。通过观察其抑菌圈大小和透明度可知，Nisin对菌株CMRC BC-1的抑制作用最强；山梨酸钾对该菌株没有抑菌效果；其他5 种防腐剂对该菌株均具有一定的抑菌活性，其中双乙酸钠、乳酸钠和脱氢乙酸钠效价较高，而葡萄糖酸-δ-内酯和亚硝酸钠效价较低。

2.6 酶标比浊法检测防腐剂对指示菌的抑制作用

表5 酶标比浊法测得防腐剂对菌株CMRC BC-1的抑菌率Table 5 Bactericidal effect of preservatives on strain CMRC BC-1 using microtiter plate assay

由表5可知，Nisin在添加量为0.1 g/L时，对菌株CMRC BC-1的抑制率就达到99.05%，效果显著，说明Nisin能有效抑制凝结芽孢杆菌的增殖生长，这与之前的研究结果相符[16]。Nisin对革兰氏阳性菌（G+）的抑制效果明显优于革兰氏阴性（G－），这主要是由于Nisin的分子质量约为3 500 D，而G－菌细胞壁组成十分致密，Nisin无法穿过，从而无法吸附细胞膜发挥抑菌作用[28]。

而乳酸钠、脱氢乙酸钠、双乙酸钠、亚硝酸钠和葡萄糖酸-δ-内酯对该菌株的抑制效果随质量浓度的增大而增强，在表2所示各自的最大添加量时，抑菌率分别为38.79%、35.39%、33.59%、18.64%和11.76%。山梨酸钾在最大添加量时没有表现出对该菌株的抑制效果。

3 结 论

中温乳化香肠在常温25 ℃贮藏过程中pH值呈下降趋势，利用选择性培养基分析其贮藏过程中微生物菌相变化，发现乳酸菌的生长繁殖是导致产品贮藏后期菌落总数超标的主要原因。从贮藏25 d的腐败样品中分离得到1 株优势腐败菌，通过形态学观察，生理生化鉴定和16S rDNA序列比对确定该菌株为凝结芽孢杆菌CMRC BC-1。该菌株生长过程产酸，24 h内pH值由5.90下降至4.55。Nisin对该菌株的抑菌浓度明显低于肉制品中允许的最大添加量，当Nisin添加量为0.1 g/L时，其抑制率就达到99.05%。山梨酸钾在其最大质量浓度范围内对该菌株没有抑制作用。其余5 种防腐剂在其最大添加量处对该菌株的抑制作用由大到小依次是乳酸钠、脱氢乙酸钠、双乙酸钠、亚硝酸钠和葡萄糖酸-δ-内酯，分别为38.79%、35.39%、33.59%、18.64%和11.76%。

微生物的生长繁殖是决定中温肉制品货架期的关键因素，本研究为中温乳化香肠乃至中温肉制品生产过程中防腐剂的选择提供了一定的理论依据。实验中分离得到的凝结芽孢杆菌会导致产品贮藏过程中变酸、菌落总数超标，但关于该菌株的致腐能力和如何影响中温肉制品品质还需进一步验证。

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Isolation， Identification and Biological Characterization of a Dominant Spoilage Strain in Emulsified Sausages Sterilized at Medium Temperature

PAN Xiaoqian, ZHAO Yan*, ZHANG Shunliang, ZHAO Bing, QIAO Xiaoling, CHEN Wenhua, LI Jiapeng, QU Chao
(China Meat Research Center, Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology, Beijing 100068, China)

A dominant spoilage bacterium designated as CMRC BC-1 from emulsified sausages sterilized at medium temperature was isolated and identified. The inhibitory potency of 7 common preservatives on the spoilage bacterium was evaluated by cylinder-plate method and microtiter plate assay. The results showed that the aerobic plate count of emulsified sausages sterilized at medium temperature had exceeded the relevant national standards on the 25thday of storage at 25 ℃. The isolate was identified as Bacillus coagulans according to the results of morphological， physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence alignment. The percent inhibition of the strain by 0.1 g/L nisin was 99.05%， demonstrating that nisin had a remarkable inhibitory activity on the strain. Six other preservatives except potassium sorbate also had definite inhibitory effect on the strain with the maximum addition， respectively.

medium-temperature sterilization； emulsified sausages； spoilage bacteria； isolation and identification；characteristics

10.7506/spkx1002-6630-201607018

TS251.1

A

1002-6630（2016）07-0093-06

潘晓倩, 赵燕, 张顺亮, 等. 中温乳化香肠中一株优势腐败菌的分离鉴定与生物学特性[J]. 食品科学, 2016, 37(7): 93-98. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607018. http://www.spkx.net.cn

PAN Xiaoqian， ZHAO Yan， ZHANG Shunliang， et al. Isolation， identification and biological characterization of a dominant spoilage strain in emulsified sausages sterilized at medium temperature［J］. Food Science， 2016， 37（7）： 93-98. （in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607018. http://www.spkx.net.cn

2015-10-30

“十二五”国家科技支撑计划项目（2015BAD28B01）

潘晓倩（1987—），女，工程师，硕士，研究方向为畜产品加工与肉制品质量安全。E-mail：go_ahead123@163.com

*通信作者：赵燕（1973—），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品加工质量安全控制和清洁生产与节能减排。

E-mail：cmrczy@126.com