降糖消渴颗粒对自发性2型糖尿病KKAy小鼠肝脏功能和氧化应激的影响

张　毅　穆倩倩　于　娜　赵丹丹　左加成　安　宏　马　越　莫芳芳　高思华

(北京中医药大学，北京，100029)



降糖消渴颗粒对自发性2型糖尿病KKAy小鼠肝脏功能和氧化应激的影响

张毅穆倩倩于娜赵丹丹左加成安宏马越莫芳芳高思华

(北京中医药大学，北京，100029)

目的：探讨降糖消渴颗粒对高脂饮食诱导的2型糖尿病KKAy小鼠肝脏功能和氧化应激的影响。方法：30只KKAy小鼠予以高脂饲料喂养4周后，建立2型糖尿病(空腹血糖≥13.9 mmol/L)小鼠模型。将成模后的KKAy小鼠随机分为模型组、吡格列酮组、降糖消渴颗颗粒高、中、低剂量组(1.75，3.5，7 g/kg)，6只C57BL/6J鼠为正常对照组。干预10周后，检测小鼠血清中ALT、AST、γ-GT、SOD、MDA含量；取肝脏组织匀浆，检测肝脏组织中MDA、SOD、GSH的含量。结果：降糖消渴颗粒低剂量(1.75 g/kg)可降低血清ALT、γ-GT、MDA水平并提高SOD活性(P<0.01)，但对肝脏中氧化应激指标无明显改善作用；中、高剂量(3.5，7 g/kg)均可显著降低血清ALT、γ-GT，减少血清及肝脏MDA含量，提高SOD活性(P<0.01)，肝脏GSH活性也有所增强(P<0.05)。高剂量还具有降低血清AST的作用(P<0.01)。结论：降糖消渴颗粒可以有效改善T2DM状态下肝脏的功能和氧化应激状态。

降糖消渴颗粒；2型糖尿病；肝脏功能；氧化应激

随着人们生活质量的提高，糖尿病(DM)发病率持续走高，其中2型糖尿病(T2DM)患者占DM总人数的90%以上，而其主要发病原因是胰岛素抵抗导致的糖脂代谢紊乱。肝脏作为机体糖脂代谢的重要器官之一，在T2DM状态下的病理存在形式主要为非乙醇性脂肪性肝病(NAFLD)[1-2]。导致这一损伤的机制可能是高脂高糖内环境下，肝细胞内抗氧化酶活性降低，产生过量的氧自由基(ROS)和氮自由基(RNS)，超过细胞自身的氧化还原能力，产生氧化应激，导致线粒体失活酶活力减低，肝细胞脂肪酸氧化能力受损，造成细胞的损伤[3-4]。

降糖消渴颗粒是以中医整体观为辨证论治思想，以肝脾肾3脏同调理论为指导，并结合现代中药炮制方法而创制的治疗DM的方剂，经前期基础研究和临床实践证实具有良好的改善胰岛素抵抗、降糖、降脂等作用[5]。本研究选用自发性T2DMKKAy小鼠为研究对象，予以高脂饲料喂养，模拟人类T2DM发病原因，探讨降糖消渴颗粒对DM小鼠肝脏功能及氧化应激的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物KKAy小鼠，雄性，8周龄，28～32 g，购自北京华阜康生物科技有限公司，许可证号SCXK(京)2012-0001。饲养于北京中医药大学屏障环境动物实验室，合格证号SCXK(京)2011-0024，环境温度22～24 ℃，相对湿度(40±10)%，12/12光照/黑暗循环。普通饲料及高脂饲料(20%蔗糖、2.5%胆固醇、10%猪油、1%胆酸钠、66.5%基础饲料)购自北京华阜康生物科技有限公司。

1.1.2仪器贝克曼全自动生化分析仪(美国Beckman公司)，BMG全波长酶标仪(德国BMG LABTECH公司)，IKA高速组织匀浆机(德国IKA公司)，分析天平。

1.1.3药物降糖消渴颗粒(丹参、生地黄、黄连、茯苓、山茱萸、生晒参等10味药依6∶6∶3∶3∶2∶2…比例组成)饮片购于河北安国药材批发市场，经北京中医药大学中药学院中药科技发展部鉴定为正品，并制成颗粒，每克含5.01 g生药。用时以蒸馏水配制相应浓度的混悬液。盐酸吡格列酮片(北京太平洋药业有限公司)。

1.1.4试剂脂质氧化测定试剂盒，总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)，GSH和GSSG检测试剂盒，均购自碧云天生物技术研究所。RIPA裂解液(Solarbio，批号：20150122)。

1.2实验方法

1.2.1动物模型制备KKAy小鼠36只，适应性饲养1周后给予高脂饲料饲养。C57BL/6J小鼠6只作为正常对照组，普通饲料喂养。KKAy小鼠高脂饲养4周后，禁食12 h后检测空腹血糖(FBG)，以FBG≥13.9 mmol·L-1为DM小鼠标准，成模率100%。

1.2.2分组及给药方法将成模后的DM小鼠按血糖，体重随机分为模型组，阳药组，降糖消渴颗粒高、中、低剂量组，每组6只。中药治疗各组灌胃给予等体积，不同浓度中药，阳药组予6.5 mg/kg吡格列酮，模型组和正常组予等体积蒸馏水灌胃。实验期间于每日上午灌胃一次，T2DM小鼠予高脂饲料饲养，正常组小鼠予普通饲料饲养，共给药10周。

1.2.3血清中相关指标检测给药10周后称取动物体重并记录，麻醉后腹主动脉取血，离心，取上层血清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)，γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)，丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)。

1.2.4肝脏中相关指标检测摘除肝脏，4 ℃预冷生理盐水冲洗后滤纸吸干，取相同部位肝组织，置于预冷的RIPA裂解液中，冰浴匀浆为10%的匀浆液。4 ℃，3 000 r/min离心15 min，取上清液按照试剂盒说明书测定肝脏MDA含量。肝脏SOD、还原型谷胱甘肽(GSH)测定方法同上。

2　结果

2.1降糖消渴颗粒对T2DM小鼠肝脏功能的影响高脂饲料喂养诱导的T2DMKKAy小鼠肝脏功能相关指标较正常小鼠显著升高(P<0.01)。给药10周后，吡格列酮与降糖消渴颗粒各剂量(1.75 g/kg，3.5 g/kg，7 g/kg)均可显著降低肝脏ALT、γ-GT含量(P<0.01)，吡格列酮和高剂量(7 g/kg)降糖消渴颗粒可有效降低血清AST含量(P<0.01)，低、中剂量组小鼠血清AST未见明显改善(P>0.05)，提示使用药物控制DM的进程可以在一定程度上减轻肝细胞的损伤。降糖消渴颗粒对肝功相关指标的改善呈现出剂量依赖性关系的趋势，高剂量(7 g/kg)效果最佳。见表1。

表1　降糖消渴颗粒对T2DM小鼠肝脏功能的影响±s)

注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01。

2.2降糖消渴颗粒对T2DM小鼠血清MDA、SOD的影响高脂饲料喂养诱导的T2DMKKAy小鼠血清中MDA含量显著高于正常组(P<0.01)，而SOD活性较正常组低(P<0.01)。给药10周后，吡格列酮有效的降低了血清MDA(P<0.01)含量且提高了SOD活性(P<0.01)。降糖消渴颗粒各剂量(1.75 g/kg，3.5 g/kg，7 g/kg)均明显改善了血清MDA、SOD，以中剂量(3.5 g/kg)效果最佳。见表2。

2.3降糖消渴颗粒对T2DM小鼠肝脏MDA、SOD、GSH的影响高脂饲料喂养诱导的T2DMKKAy小鼠肝脏中MDA含量较正常组显著升高(P<0.01)，SOD、GSH活性则较正常组降低。给药10周后，吡格列酮组小鼠GSH活性有所升高(P<0.05)，而MDA含量和SOD活性与模型组小鼠比较未见统计学意义。低剂量(1.75 g/kg)降糖消渴颗粒对肝脏氧化应激没有明显改善作用，中、高剂量(3.5 g/kg，7 g/kg)降糖消渴颗粒可显著降低肝脏中MDA含量(P<0.01)，提高SOD活性(P<0.01)，且GSH活性也较模型组小鼠有所提高(P<0.05)。高剂量效果稍优于中剂量，但无统计学意义。见表3。

表2　降糖消渴颗粒对T2DM小鼠血清MDA、SOD的影响

注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01。

表3　降糖消渴颗粒对T2DM小鼠肝脏MDA、SOD、GSH的影响

注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01。

3　讨论

T2DM条件下的肝脏病变主要表现为NAFLD，1998年Day等提出的“二次打击”学说[6]阐明了其病理机制：在胰岛素抵抗情况下，肝细胞内脂质沉积导致脂肪肝的形成；活化的内源性损害因子通过氧化应激使反应性活性氧(ROS)增多，导致肝细胞内脂质过氧化增强，线粒体功能受损，细胞产生炎性反应，肝损伤进一步加剧[7-8]。MDA是ROS与细胞膜磷脂中的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的产物，是评价机体氧化应激发生的重要指标[9]。

DM是现代医学中的病名，传统中医学并无此名，而多将此类疾病归属于“消渴”范畴。中医辨证多属肝脾肾三脏功能失常，以某一脏失调为主，渐次波及其余两脏，且多虚实夹杂，气阴两虚挟气滞、血瘀、湿(痰)凝、热结[10]。临床治疗当扶正兼顾祛邪，恢复肝脾肾三脏功能。降糖消渴颗粒是结合现代DM的发病特点，立足肝脾肾，3脏同调而创制的系列方之一，本方以地黄汤为底方加减变化，滋肾荣肝，凉血活血且兼补血，同时健脾渗湿，更以黄连清热泻火[11]。

本实验中DM小鼠血清和肝脏中MDA含量都较正常组显著升高，说明高脂饲料喂养诱导的T2DM小鼠体内发生了明显的氧化应激，而ALT、AST的升高则说明DM小鼠肝细胞受损，这可能是由氧化应激导致的。经过降糖消渴颗粒给药治疗后，各组小鼠肝脏中氧化应激的水平都得到了不同程度的减轻。在改善肝功方面，降糖消渴颗粒呈现出剂量依赖性趋势，高剂量(7 g/kg)较中、低剂量更能明显降低血清中ALT、AST含量，对肝细胞保护作用较强；在改善血清及肝脏中氧化应激指标方面，中、高剂量(3.5，7 g/kg)降糖消渴颗粒都具有明显优势，这说明降糖消渴颗粒可在一定程度上降低DM状态下肝细胞内的氧化应激，提高体内抗氧化酶活性，减轻肝细胞损伤，从而起到保护肝脏的作用。而降糖消渴颗粒发挥这一作用的机制是本身作为一种抗氧化剂，纠正机体氧化失衡状态，还是通过改善胰岛素抵抗状态从而减轻肝细胞炎性反应，仍需进一步研究。

综上所述，降糖消渴颗粒对DM状态下的肝脏损伤具有一定的保护作用，其作用可能是通过增强肝细胞抗氧化能力实现的。

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(2015-10-11收稿责任编辑：徐颖)

Effect of Jiangtang Xiaoke Granule on Hepatic Function and Oxidative Stress in Type 2 Diabetic KKAy Mice

Zhang Yi, Mu Qianqian, Yu Na, Zhao Dandan, Zuo Jiacheng, An Hong, Ma Yue, Mo Fangfang, Gao Sihua

(Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Objective: To investigate the effect of Jiangtang Xiaoke granule (JTXKG) on hepatic function and oxidative stress in type 2 diabetic KKAy mice. Methods: A total of 30 KKAy mice were fed by high-fat-diet for 4 weeks, T2DM model were established by FBG≥11.1 mmol·L-1. The T2DM mice were then randomly divided into model group, pioglitazone group and JTXK granule groups in low (1.75 g/kg), medium (3.5 g/kg), and high (7 g/kg) doses. The normal group had 6 C57BL/6J in it. After 10-week treatment, the serum ALT, AST, γ-GT, MDA, SOD and hepatic MDA, SOD, GSH were measured. Results: Compared with model group, T2DM mice supplemented with 1.75 g/kg dose of JTXK granule has lower serum ALT, γ-GT, MDA (P<0.01) and higher SOD activity (P<0.05). However, it has little effect on hepatic oxidative stress index. T2DM mice fed with 3.5 and 7 g/kg dose of JTXK granule has lower serum ALT, γ-GT, serum and hepatic MDA and higher SOD, GSH activities significantly (P<0.01). Conclusion: JTXKG can improve hepatic function and oxidative stress in T2DM mice.

Jiangtang Xiaoke granule; Type 2 diabetes; Hepatic funciton; Oxidative stress

重大新药创制(编号：2012ZX09103201-005)；科学研究与研究生教育-科学研究与科研基地建设项目-治疗代谢综合征创新中药临床前研究(编号：1000062520025)

张毅(1986.03—)，女，博士研究生在读，研究方向：中医药防治糖尿病，E-mail：yicando@163.com

高思华(1957.07—)，男，博士，教授，研究方向：中医药防治内分泌代谢性疾病，E-mail：gaosihua1216@163.com

R242;R285;R587.1

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.053