威灵仙总皂苷对实验性NASH大鼠模型血清IL-6、IL-17、TNF-α水平和肝脏病理的影响*

闫福媛 琚 坚 高 藩 王晓青

昆明医科大学第二附属医院特需病房科(650101)



威灵仙总皂苷对实验性NASH大鼠模型血清IL-6、IL-17、TNF-α水平和肝脏病理的影响*

闫福媛#琚 坚&高 藩 王晓青

昆明医科大学第二附属医院特需病房科(650101)

背景：中药威灵仙化学成分多样，药理作用广泛。前期研究显示威灵仙能有效干预实验性肝纤维化。目的：研究威灵仙总皂苷对实验性非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠模型血清炎症细胞因子和肝脏病理的干预作用。方法：以高脂饲料饲养16周诱导实验性NASH大鼠模型，分别予多烯磷脂酰胆碱和威灵仙总皂苷灌胃干预8周，同时设置不予药物干预的模型组和以普通饲料饲养的空白组。以ELISA法检测血清白细胞介素-6(IL-6)、IL-17、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，以非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活动度积分评估肝脏脂肪变性分度和炎症分级。结果：经8周药物干预后，威灵仙总皂苷组血清IL-6、IL-17、TNF-α水平显著低于模型组(P<0.01)，与空白组间差异无统计学意义(P>0.05)，肝脏脂肪变性分度和炎症分级亦较模型组显著减轻(P<0.05)，与临床常用保肝药物多烯磷脂酰胆碱的作用无明显差异(P>0.05)。结论：威灵仙总皂苷可有效改善实验性NASH大鼠模型的肝脏脂肪变性和炎症损伤，降低血清炎症细胞因子水平，疗效与多烯磷脂酰胆碱相当。其机制可能与调节肝脏免疫、对抗肝脏氧化应激、改善胰岛素抵抗等有关。

威灵仙； 皂苷类； 非酒精性脂肪性肝炎； 白细胞介素6； 白细胞介素17； 肿瘤坏死因子α

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指除外乙醇以及其他明确的肝损害因素，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪性肝病以及由其演变而来的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)、肝纤维化和肝硬化[1]。NAFLD与酒精性脂肪性肝病的演进过程一致，依次为脂肪肝→脂肪性肝炎→脂肪性肝纤维化→肝硬化→肝癌，因此NASH是NAFLD发展为肝硬化乃至肝癌的关键步骤。中药威灵仙是毛茛科铁线莲属植物威灵仙、棉团铁线莲、东北铁线莲的干燥根和根茎，具有祛风湿、通经络之功效[2]。威灵仙化学成分多样，目前研究最多的是其中的多糖类和皂苷类物质。威灵仙皂苷成分药理作用广泛，包括免疫抑制[3]、抗氧化[4]、抗炎[4-5]、抗肿瘤[6]等。本课题组前期研究[7]显示威灵仙能有效干预大鼠实验性肝纤维化，效果与临床常用保肝药物多烯磷脂酰胆碱无明显差异。本研究通过比较威灵仙总皂苷和多烯磷脂酰胆碱对实验性NASH大鼠模型血清炎症细胞因子和肝脏病理的干预作用, 探讨应用威灵仙总皂苷治疗NSAH的价值。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠50只，平均体质量(70±10) g，购自昆明医科大学动物实验中心，许可证：SCXK(滇)2005-0008。大鼠饲养于昆明医科大学动物实验中心，于安静环境中分笼饲养，室温(22±2) ℃，湿度50%±5%，通风良好，自然昼夜光线，自由进食、饮水。猪油(昆明市农贸市场)，蛋黄粉、胆固醇、胆酸钠(上海源叶生物科技有限公司)，多烯磷脂酰胆碱胶囊[228 mg/粒，商品名：易善复，国药准字H20059010，赛诺菲(北京)制药有限公司]，威灵仙总皂苷(安徽大学生命科学学院)，大鼠血清白细胞介素-6(IL-6)、IL-17 ELISA检测试剂盒(eBioscience, Thermo Fisher Scientific Inc.)，大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA检测试剂盒(RayBiotech, Inc.)。

二、方法

1. 造模阶段动物分组和NASH模型建立[8]：从50只大鼠中随机抽取14只组成空白组，其余36只作为模型组。空白组予普通饲料饲养16 周；模型组予高脂饲料(82.5%普通饲料+10%猪油+5%蛋黄粉+2%胆固醇+0.5%胆酸钠)饲养16 周。两组分别于4、8、12、16周末各取1只、1只、2只、2只大鼠，处死后取出肝脏，在肝右叶中央部取1.0 cm×0.5 cm大小的肝组织，迅速于0.9% NaCl溶液中漂洗，4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，连续冠状切片，行HE染色，观察肝组织病理学变化。检查结果显示高脂饲料饲养16周可成功建立实验性NASH大鼠模型。

2. 药物干预阶段动物分组和干预：实验性NASH大鼠模型成功建立后，原模型组剩余30只大鼠随机分为模型组、多烯磷脂酰胆碱组和威灵仙总皂苷组，每组10只；原空白组剩余8只大鼠仍作为空白组。多烯磷脂酰胆碱组、威灵仙总皂苷组大鼠分别予多烯磷脂酰胆碱(195.4 mg·kg-1·d-1)、威灵仙总皂苷(纯度61.5%，50 mg·kg-1·d-1)，以 0.9% NaCl配制成3 mL溶液灌胃，模型组、空白组大鼠予0.9% NaCl溶液3 mL灌胃，每日上午9时灌胃一次，共8 周。

3. 血清标本采集和细胞因子检测：药物干预结束后，大鼠禁食、禁水24 h，3%戊巴比妥钠0.10～0.15 mL/100 g腹腔麻醉，下腔静脉采血，离心、分离血清，以ELISA法测定IL-6、IL-17、TNF-α水平，操作严格按试剂盒说明书进行。

4. 肝组织病理学评估：药物干预结束后腹腔麻醉处死大鼠，取出肝脏，病理切片制备同造模阶段。参照中华医学会肝病学分会制订的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)》进行NAFLD活动度积分(NAFLD activity score, NAS)评估[9]。肝细胞脂肪变性：0分，<5%；1分，5%～33%；2分，34%～66%；3分，>66%。小叶内炎症(20倍视野计数坏死灶)：0分，无；1分，<2个；2分，2～4个；3分，>4个。肝细胞气球样变：0分，无；1分，少见；2分，多见。总分为0～8分。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况

采用高脂饲料饲养16周可成功建立实验性NASH大鼠模型，肝组织无肝纤维化。空白组大鼠肝脏大体观察体积正常，表面光滑有光泽，色粉红，触之质软，肝组织切片未见明显肝细胞脂肪变、气球样变、炎症坏死或纤维化；模型组大鼠肝脏体积增大，表面光泽差，色淡黄，切之有油腻感，可见肝细胞脂肪变和较多气球样变，门管区大量炎性细胞浸润(图1)。

A、B：空白组；C、D：模型组；A、C：大体表现；B、D：组织学表现(HE染色，×200)

图1 空白组和模型组大鼠高脂饮食16周末肝脏大体和组织 学表现

二、血清IL-6、IL-17、TNF-α水平

经8周药物干预后，多烯磷脂酰胆碱组、威灵仙总皂苷组血清IL-6、IL-17、TNF-α水平均显著低于模型组(P<0.01)，多烯磷脂酰胆碱组与威灵仙总皂苷组间差异则无统计学意义(P>0.05)，两组与空白组间差异亦无统计学意义(P>0.05)(表1)。

三、肝脏脂肪变性分度和炎症分级

8周末，模型组表现为Ⅳ度肝细胞脂肪变性，肝细胞较多气球样变，部分门管区少量炎性细胞浸润，小叶内多数有灶状坏死。多烯磷脂酰胆碱组、威灵仙总皂苷组经8周药物干预后，肝脏脂肪变性分度和炎症分级较模型组显著减轻(P<0.01,P<0.05)，多烯磷脂酰胆碱组与威灵仙总皂苷组间差异则无统计学意义(P>0.05)，但两组仍显著高于空白组(P<0.01)(表2)。

表2 各组肝脏脂肪变性分度、炎症分级比较

*与空白组比较，P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，▲P<0.01

讨 论

中药威灵仙化学成分复杂，主要有挥发性和非挥发性成分两大类，前者主要包括棕榈酸3-羟基-4-甲氧基苯甲醛、二十碳烷等，后者主要包括三萜及其苷类、黄酮和多元酚类、有机酸类、生物碱类等[10]。威灵仙的药理作用广泛，如苷类中的原白头翁素和白头翁素有抑菌、抗菌活性；皂苷类具有镇痛抗炎、免疫抑制、抗纤维化、抗氧化、抗肿瘤、降低尿酸作用；多糖类具有抗肿瘤、抗氧化作用；黄酮类有利胆作用等[3-6,10-11]。文献报道皂苷元齐墩果酸可对多种原因引起的急性肝损伤发挥保护作用，并具有抑制肝星状细胞(HSC)收缩、抗肝纤维化、抗门静脉高压作用[12-13]。本研究通过血清炎症细胞因子IL-6、IL-17、TNF-α检测以及肝脏脂肪变性分度和炎症分级评估，对威灵仙化学成分中的总皂苷对NASH这一NAFLD进展至肝硬化的关键环节的干预作用及其可能机制进行了探讨。

表1 各组血清炎症细胞因子水平比较±s, pg/mL)

*与模型组比较，P<0.01

IL-6是一种促炎细胞因子，然而关于其在NAFLD的发生、发展中是起正性还是负性作用，目前并无明确的循证医学证据。有研究发现IL-6能抑制胰岛素受体底物1(IRS1)，从而影响胰岛素受体与底物结合后的信号转导，导致胰岛素抵抗发生[14-16]。然而亦有研究[17]指出，尽管一般程度地阻断IL-6-STAT3信号通路可减轻NASH肝损伤，但对于重度NASH，IL-6信号是一个保护因素，以蛋氨酸胆碱缺乏饮食在db/db肥胖小鼠(本身即存在STAT3活化受损)中诱导NASH，予抗小鼠IL-6受体特异性抗体以进一步阻断STAT3活化可增强肝脏内脂质过氧化/氧化应激，进而加重肝损伤。Kroy等[18]的研究显示，以胆碱缺乏乙硫氨酸补充饮食诱导NASH，IL-6缺陷小鼠更易发生肝脏脂肪变性和炎症损伤，导致重度NASH，伴高糖血症和血清胰岛素水平升高。Miller等[19]发现，抗炎细胞因子IL-10缺陷小鼠出现严重的肝脏炎症反应，伴IL-6水平升高和STAT3激活，但给予乙醇或高脂饮食后并不发生严重肝脏脂肪变性和肝细胞损伤，在IL-10缺陷小鼠中敲除IL-6或STAT3则可引起肝脏脂肪变性和肝细胞损伤，且肝脏炎症反应进一步加重，提示IL-6-STAT3信号激活有抗脂肪变性作用。本研究中实验性NASH大鼠模型血清IL-6水平显著升高，这提示对于NASH的发生、发展，IL-6主要起促进作用。

IL-17是由Th17细胞分泌的重要的促炎细胞因子，有研究发现肥胖人群中存在IL-17轴激活，在NAFLD的发生以及由单纯性脂肪性肝病向NASH转变中起极为重要的作用[20-21]。在IL-17A受体(IL-17RA)缺陷小鼠中，高脂饮食可引起内脏脂肪沉积、肝脏脂肪变性，但并不发生严重的脂肪性肝炎和肝细胞损伤[20]。体外实验发现IL-17可引起胰岛素抵抗，导致肝细胞发生脂肪变性；高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏中Th17细胞数量显著增多，予中和IL-17后，模型小鼠由脂多糖诱导的肝损伤明显减轻，血清ALT水平降低，肝脏炎症细胞浸润减少；NASH患者肝脏中IL-17阳性细胞浸润亦显著增多[21]。本研究中，实验性NASH大鼠模型血清IL-17水平升高显著，与上述研究结果相符。

目前研究认为TNF-α可通过多条途径促进NAFLD进展：①诱导STAT3表达，抑制胰岛素受体，从而阻碍胰岛素信号转导，引起胰岛素抵抗[15]。②诱导低密度脂蛋白受体表达，抑制胆固醇向肝外转运，导致肝内胆固醇蓄积，消耗线粒体中的谷胱甘肽，使肝细胞中活性氧生成增加，加剧氧化应激，加重肝细胞损伤[22]。此外，肝细胞内有大量脂质蓄积时，TNF-α可上调细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)表达，激活蛋白激酶通路，导致肝细胞损伤、凋亡[23]。本研究中，实验性NASH大鼠模型血清TNF-α水平升高显著，证实其参与了NASH的发生。

本组实验性NASH大鼠模型经威灵仙总皂苷干预8周后，肝脏脂肪变性和炎症损伤明显减轻，同时血清IL-6、IL-17、TNF-α降低至正常水平，与临床常用保肝药物多烯磷脂酰胆碱疗效相当。推测威灵仙总皂苷可能通过改善肝脏脂肪变性、减轻肝细胞炎症、调节肝脏免疫、对抗肝脏氧化应激、改善胰岛素抵抗、调节肝脏Kupffer细胞吞噬功能等途径[15]，降低NASH大鼠模型的血清炎症细胞因子水平，减轻肝组织损伤，达到有效治疗和改善NASH的目的。确切机制有待进一步深入探讨。

NAFLD是一组多机制、多进程的代谢性疾病，其发病机制错综复杂，主流观点为“二次打击”学说。炎症因子中的细胞因子作为“二次打击”学说中“第二次打击”的关键因素，在 NASH的发生、发展中起重要作用。目前尚无针对NASH的特效药物，因此阐明细胞因子在NAFLD疾病进程中的作用机制及其确切作用环节，寻找其中的关键因子作为NASH治疗的靶点具有广泛临床应用前景。威灵仙总皂苷能有效降低高脂饮食诱导的NASH大鼠模型的血清IL-6、IL-17、TNF-α水平，改善肝脏病理表现，或许能为NASH的治疗和预防提供新思路。本实验样本量较小，抽样误差大，且高脂饲料饲养大鼠16周无法建立肝纤维化模型，后续研究拟扩大样本量，建立有肝纤维化表现的大鼠模型并行纤维化Masson染色以弥补上述缺陷，明确威灵仙总皂苷对肝纤维化是否有预防和治疗作用。

1 葛均波，徐永健. 内科学[M]. 8版. 北京: 人民卫生出版社, 2013: 408.

2 国家药典委员会. 2010年版中华人民共和国药典: 一部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010: 234-235.

3 夏伦祝，徐先祥，张睿. 威灵仙总皂苷对小鼠免疫功能的影响[J]. 安徽医药, 2009, 13 (5): 496-497.

4 夏伦祝，徐先祥，张睿. 威灵仙总皂苷对角叉菜胶致炎大鼠的抗炎作用[J]. 安徽中医学院学报, 2009, 28 (3): 41-43.

5 周效思，周凯，封芬. 威灵仙对兔膝骨关节炎IL-1β、TNF-α、PGE2的影响[J]. 时珍国医国药, 2011, 22 (5): 1143-1144.

6 周云，黄纯兰，李录克，等. 威灵仙皂苷对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞的凋亡诱导作用及其机制[J]. 肿瘤防治研究, 2011, 38 (8): 881-885.

7 向虹，琚坚. 威灵仙对实验性肝纤维化的干预作用[J]. 中国中西医结合消化杂志, 2014, 22 (7): 377-380.

8 王伟. 威灵仙总皂苷干预实验性NASH大鼠内毒素血症的疗效观察[D]. 昆明: 昆明医科大学, 2014.

9 中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组. 非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)[J]. 中华肝脏病杂志, 2010, 18 (3): 163-166.

10 李颜，郭澄. 威灵仙化学成分和药理作用研究进展[J]. 中国药房, 2008, 19 (33): 2626-2628.

11 罗奎元，强宇靖，高慧琴. 威灵仙化学成分及药理作用研究进展[J]. 甘肃中医学院学报, 2015, 32 (5): 60-63.

12 张明发，沈雅琴. 齐墩果酸和熊果酸保肝药理作用的研究进展[J]. 抗感染药学, 2012, 9 (1): 13-19.

13 刘昌辉，黄小桃，李颖仪，等. 齐墩果酸对肝星状细胞收缩的抑制作用及其机制研究[J]. 中药新药与临床药理, 2012, 23 (6): 606-609.

14 Tilg H, Moschen AR. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: the multiple parallel hits hypothesis[J]. Hepatology, 2010, 52 (5): 1836-1846.

15 Neuschwander-Tetri BA. Hepatic lipotoxicity and the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis: the central role of nontriglyceride fatty acid metabolites[J]. Hepatology, 2010, 52 (2): 774-788.

16 Park EJ, Lee JH, Yu GY, et al. Dietary and genetic obesity promote liver inflammation and tumorigenesis by enhancing IL-6 and TNF expression[J]. Cell, 2010, 140 (2): 197-208.

17 Yamaguchi K, Itoh Y, Yokomizo C, et al. Blockade of IL-6 signaling exacerbates liver injury and suppresses antiapoptotic gene expression in methionine choline-deficient diet-fed db/db mice[J]. Lab Invest, 2011, 91 (4): 609-618.

18 Kroy DC, Beraza N, Tschaharganeh DF, et al. Lack of interleukin-6/glycoprotein 130/signal transducers and activators of transcription-3 signaling in hepatocytes predisposes to liver steatosis and injury in mice[J]. Hepatology, 2010, 51 (2): 463-473.

19 Miller AM, Wang H, Bertola A, et al. Inflammation-associated interleukin-6/signal transducer and activator of transcription 3 activation ameliorates alcoholic and nonalcoholic fatty liver diseases in interleukin-10-deficient mice[J]. Hepatology, 2011, 54 (3): 846-856.

20 Harley IT, Stankiewicz TE, Giles DA, et al. IL-17 signaling accelerates the progression of nonalcoholic fatty liver disease in mice[J]. Hepatology, 2014, 59 (5): 1830-1839.

21 Tang Y, Bian Z, Zhao L, et al. Interleukin-17 exacerbates hepatic steatosis and inflammation in non-alcoholic fatty liver disease[J]. Clin Exp Immunol, 2011, 166 (2): 281-290.

22 Kodama Y, Taura K, Miura K, et al. Antiapoptotic effect of c-Jun N-terminal Kinase-1 through Mcl-1 stabilization in TNF-induced hepatocyte apoptosis[J]. Gastroenterology, 2009, 136 (4): 1423-1434.

23 Miura K, Seki E, Ohnishi H, et al. Role of toll-like receptors and their downstream molecules in the development of nonalcoholic fatty liver disease[J]. Gastroenterol Res Pract, 2010, 2010: 362847.

(2016-01-18收稿；2016-02-04修回)

Effect of Total Saponins of Radix clematidis on Serum IL-6, IL-17, TNF-α and Liver Pathology in Experimental NASH Rats

YANFuyuan,JUJian,GAOFan,WANGXiaoqing.

DepartmentofSpecialWard,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming(650101)

JU Jian, Email: jujianyn@163.com

CLEMATIS CHINENSIS; Saponins; Non-Alcoholic Steatohepatitis; Interleukin-6;Interleukin-17; Tumor Necrosis Factor-alpha

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.09.003

云南省卫生科技计划基金(2012WS0091)

#Email: 2374322904@qq.com

&本文通信作者，Email: jujianyn@163.com

Background: Radix clematidis is a Chinese herbal medicine with complex chemical components and broad pharmacological activities. It has been demonstrated that Radix clematidis is effective in treating experimental liver fibrosis. Aims: To investigate the intervention effect of total saponins of Radix clematidis on serum inflammatory cytokines and liver pathology in rats with experimental non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Methods: Sprague-Dawley rats were fed with high fat diet for 16 weeks to induce experimental NASH and then received polyene phosphatidyl choline or total saponins of Radix clematidis intragastrically for 8 weeks. Rats fed with high fat diet without drug intervention and rats fed with normal diet were served as NASH control and blank control, respectively. Serum levels of interleukin-6 (IL-6), IL-17 and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by ELISA method, the hepatic steatosis and inflammation were evaluated by using non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score. Results: After 8 weeks intervention, serum levels of IL-6, IL-17 and TNF-α were significantly decreased in total saponins group than in NASH control group (P<0.01), and no significant difference was seen between total saponins group and blank control group (P>0.05). Severity of hepatic steatosis and inflammation were also reduced markedly in total saponins group (P<0.05). The efficacy of total saponins of Radix clematidis was similar to that of polyene phosphatidyl choline, a commonly used hepatoprotective agent (P>0.05). Conclusions: Total saponins of Radix clematidis is effective for ameliorating hepatic steatosis and inflammatory injury and reducing serum inflammatory cytokines in rats with experimental NASH, the efficacy is equal to polyene phosphatidyl choline. Total saponins of Radix clematidis may exerts the therapeutic effect on NASH by its immunomodulation, antioxidant and anti-insulin resistance activities.