牛耳朵组培快繁体系的建立及优化

娄 丽 李从瑞 侯 娜 杨成华 邓伦秀

(贵州省林业科学研究院 贵阳 550005)



牛耳朵组培快繁体系的建立及优化

娄 丽 李从瑞 侯 娜*杨成华 邓伦秀

(贵州省林业科学研究院 贵阳 550005)

以当年生长良好的牛耳朵叶片为外植体,通过对外植体的消毒、不定芽诱导、增殖及生根培养，筛选高效稳定的无菌芽诱导优化体系。结果表明:外植体最佳消毒方法为用70%酒精浸泡30s，3%NaClO消毒2.0 min；不定芽诱导最佳培养基为: WPM+6-BA3.0mg/L+2-ip 1.0mg/L+NAA0.1mg/L，诱导率为83.23%；不定芽增殖最佳培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L，增殖系数为16.0，且不定芽长势良好；生根培养基以1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.05mg/L为较好，生根率达92.35%。以腐殖土：珍珠岩=3:1为移栽基质的成活率最高达100%。

牛耳朵；芽诱导；培养基

牛耳朵(ChiritaeburneanHanc)为苦苣苔科唇柱苣苔属植物，根和全草入药，其味甘、性平,具有补虚、止咳、解毒等药用功效[1～4]。唇柱苣苔属植物全世界约130种；其中约81种分布在我国的西南、华南向东达浙江、福建、台湾，湖北、湖南、广东、广西、贵州、四川等地[2～6]。牛耳朵是多年生草本植物,花1～15朵,花序基部有苞叶,宽卵形或卵形,叶面被密毛。花冠管圆柱状,呈紫色或淡紫色，花期4～7月。其在海拔400～1200米的石灰岩山地或山沟边林下生长，适于疏松肥沃的酸性或微酸性土壤。牛耳朵叶四季常青,花期长、花色艳丽,尤其是开花前期花梗顶端苞片外缘呈紫红色,作室内盆栽观赏效果佳；牛耳朵还可用于露地花坛、草坪及地被植物栽培，具有极高的园林景观开发前景，是一个正待开发的观赏植物[2～3]。 目前，吴建璋等初步研究表明牛耳朵提取物对自发性高血压有显著的药用功效，其作为药用植物虽然尚未进入开发阶段，但具有极大的开发潜力。

牛耳朵采用播种繁殖、扦插繁殖，繁殖速度慢，后代易产生遗传变异。温放[6]等对牛耳朵在组织培养方面进行了研究，研究结果表明，不定芽的诱导率仅为73%，存在诱导率低、丛生芽增殖系数较低的缺点。本研究以牛耳朵叶片为外植体，对其无菌体系建立、不定芽诱导、继代增殖、生根等一系列问题进行了研究，筛选各阶段最佳培养基配方，建立牛耳朵芽诱导高频植株体系。旨在为其标准规模化育苗提供技术理论支撑，对生产实践意义极为重要。

1 材料与方法

1.1 材料来源

供试材料为贵州省荔波茂兰自然保护区的牛耳朵(ChiritaeburneanHanc)，以当年生长良好的叶片为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒

将室外采集的叶片经流水冲洗1h，先用70%酒精不同时间处理叶片，无菌水冲洗3～5次。再用3%NaClO消毒，3%NaClO消毒时间为2.0min、4.0min、6.0min和8.0min。灭菌后无菌水冲洗3～5次，接种在MS培养基上，添加蔗糖25g/L和琼脂5g/L,调节pH值5.8；每瓶1个外植体，每一处理接种30瓶，培养温度25±2℃，放置于光照培养箱内，暗培养7d，然后转移到光照强度1500～2000lx，每天光照12h，光照培养3d,观察记录污染数和成活数。萌发率(%)=腋芽萌发数/接种数(不包括污染数)。

1.2.2 诱导不定芽

将无菌外植体叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，转接到添加不同浓度6-BA,2-ip和NAA的WPM培养基上，进行叶片诱导不定芽的影响因子研究。当6-BA 浓度为3.0mg/L和NAA浓度为0.1mg/L，2-ip浓度为0.1,0.5,1.0,1.5,2.0和2.5mg/L 6个浓度梯度，30d统计不定芽萌芽情况。每个处理30瓶，每个处理重复3次，放置在温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h的环境。丛生芽诱导率(%)=诱导出不定芽芽的腋芽数/接种的腋芽数。

1.2.3 牛耳朵不定芽增殖

将叶片诱导的不定芽，接种到添加不同浓度的6-BA、NAA、GA3的MS培养基上进行培养。30d统计不定芽增殖情况。每个处理30瓶，每个处理重复3次，放置于在温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h。增殖系数=诱导后不定芽的数/诱导前不定芽的数。

1.2.4 牛耳朵不定芽生根

将不定芽切成单芽，接种在浓度为0.1 mg/L IBA、0.05 mg/L NAA、0.1 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA和不加激素的1/2MS培养基上。每个处理接种30瓶，每个处理重复3次，放置于在温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h。观察记录生根情况并计算生根率。生根率=生根小苗数/总苗数×100%。

1.2.5 炼苗与移栽

将生根组培苗揭开瓶盖，在室内自然条件下炼苗7d；将苗移出培养瓶，用毛刷轻轻清洗根上的培养基。初步研究使用炼苗基质为腐殖土、黄土、树皮、珍珠岩4种，按不同配比，设置4个处理：I腐殖土；Ⅱ黄土；Ⅲ黄土：珍珠岩=3:1；Ⅳ腐殖土：珍珠岩=3:1。所用移栽基质经高锰酸钾消毒，将苗移栽入基质中，覆膜以及定期浇水保持空气湿度，栽后30d统计苗成活率。

1.3 数据处理方法

Excel 2007进行数据统计处理； SPSS 19.0对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对牛耳朵成活率的影响

消毒剂种类和消毒时间长短对外植体的影响较大，适宜的消毒剂和处理时间可有效降低污染数，减少组织污染死亡，提高外植体的成活率(表1)。结果表明70%酒精消毒时间30s+3%NaClO灭菌4min，污染率较低，成活率为57%；当3%NaClO浸泡时间增加至6min，污染率和成活率都下降。因此采用70%酒精处理30s+3%NaClO浸泡4min的消毒灭菌，牛耳朵叶片外植体能得到较高的成活率和较低的污染率。

表1 不同消毒处理结果统计表

2.2 不同浓度激素对叶片诱导不定芽的影响

牛耳朵接种于表2所示的培养基上培养45d左右形成一簇生芽﹙图A﹚。试验发现，在前30d的培养过程中，芽分化和生长速度较慢，但继续培养25d后，丛生芽的诱导数量增多，生长速度加快。在6-BA和NAA浓度一定，2-ip浓度在0.1～2.5mg/L之间变化时，叶片丛生芽的诱导率呈先上升后下降的趋势，在1.0mg/L时，诱导率达到最高，为83.23%；NAA浓度保持不变时，低浓度的2-ip不利于无菌芽的分化，诱导率和平均发芽数随着2-ip浓度的增加先升高后下降，在1.0mg/L时达到最高；而高于1.0mg/L时，玻璃化现象严重，诱导率反而下降。因此，在6-BA浓度3.0mg/L 和NAA浓度为0.1mg/L时，2-ip浓度为1.0mg/L更适合诱导丛生芽，诱导率达到最高，为83.23%，平均萌芽数为15.32个。因此，叶片诱导丛生芽的最佳培养基为WPM+6-BA3.0mg/L+2-ip 1.0mg/L+NAA0.1mg/L。

表2 不同浓度激素对牛耳朵叶片不定芽的诱导情况

2.3 不同浓度激素对不定芽增殖的影响

不同浓度激素对不定芽增殖的影响见表3。方差分析进行多重比较：不同浓度激素处理对牛耳朵不定芽增殖有显著差异。观察发现6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L为牛耳朵不定芽增殖最佳激素配比，分化不定芽较快，很快形成小植株，且数量多，部分分生出细根；无菌芽在该培养基上20天后开始萌发，平均分化不定芽16.34个，在该组合培养基上，接种30天左右，分化的不定芽形成植株形态，具有3～4片叶片(图B)。

2.4 不同浓度激素处理对生根的影响

将有2～4片叶的无根苗转接入生根培养基上，接种15d左右观察有白色细长的根发生﹙图C﹚。对不同试验号进行多重比较方差分析(表4)，结果显示不同激素组合处理对牛耳朵生根的影响表现差异显著。各处理的均值大小依次为4(92.35%)﹥3(82.30%)﹥2(52.12%)﹥1(32.18%)；结果表明一定激素浓度的IBA和NAA组合对牛耳朵生根有促进作用，诱导牛耳朵生根最佳组合为4号培养基，即：1/2MS+NAA0.05 mg/L +IBA0.1mg/L，植株须根多，生长良好，生根率平均可达92.35%。

表3 不同浓度激素处理对不定芽增殖生长的影响

注：表中小写字母表示同一激素在0.05水平上的显著性差异(下同)。

表4 激素处理对牛耳朵不定芽诱导生根情况

2.5 炼苗与移栽

经过生根培养的组培苗，炼苗7d，使其适应外界环境，移栽在已消毒的3:1的腐殖土：珍珠岩中，浇水，覆膜，70%的遮阳网覆盖遮阴。结果表明：8月移栽，30d后，移栽苗生长良好，移栽成活率100%以上﹙图D﹚，且正常开花(图E)。

3 结论与讨论

由于牛耳朵叶片上有短茸毛,在表面消毒时加大了灭菌的难度；在植物组织培养过程中，外植体消毒是关键一步。许多研究者采用升汞消毒，但是升汞消毒后难去除残留的汞，本研究中采用当年生长良好的叶片，经流水冲洗1h，先用70%酒精处理30s，再用3%NaClO消毒灭菌4min的方法，使无菌外植体成活率为57%，污染率降低为26.67%。

不同类型植物对培养基具有选择性，通常情况下草本植物用MS为基本培养基，WPM培养基用于木本植物。温放[6～7]等对黄花牛耳朵、牛耳朵组织培养的研究结果表明：采用MS为基本培养基，诱导率仅为73%，本研究用WPM为基本培养基进行诱导不定芽，极大缩短诱导芽时间，同时增加不定芽的数量。因此，当外植体难诱导不定芽的草本植物时可采用WPM培养基。合适的激素种类及浓度可有效促进不定芽的诱导及增殖，牛耳朵叶片诱导不定芽的试验结果显示，浓度为1.0mg/L的2-ip有利于芽诱导，诱导率为83.23%。MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L明显促进不定芽的增殖。牛耳朵最适生根培养基配方为1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L。适宜浓度的NAA和IBA对不定根的发生有明显的促进作用，生根率平均可达92.35%，且植株的叶片生长健壮，长势良好。室外移栽时，牛耳朵组培苗对空气相对湿度要求较高，移栽注意浇水保湿，移栽适宜基质为腐殖土：珍珠岩=3︰1，成活率达100%以上。因此，本试验建立的牛耳朵组培快繁体系具有周期短、增殖系数大、成活率高等优点，适合在生产上规模化推广应用。本研究仅对牛耳朵芽诱导、增殖及生根快繁技术重要环节进行了研究，但有关光照和温度等环境条件在牛耳朵组培快繁的影响有待进一步研究。

注：A.不定芽诱导;B.不定芽增殖;C生根培养;D.炼苗;E.开花植株图1 牛耳朵芽诱导体系不同阶段及开花状态

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Establishment and Optimization of Technique system of Tissue Culture forChiritaeburneanHanc

LOU Li LI Cong-rui HOU Na* YANGg Chen-hua DENG Lun-xiu

(Guizhou Academy of Forestry, Guiyang, Guizhou 550005)

The shoots were induced in vitro from Chirita eburnean Hanc leaflets through disinfection, adventitious shoots induction, proliferation and rooting culture.The results showed that the best method for the explant disinfection was “30s soaked in 70% alcohol”， 3%NaClO disinfection 2min; The best medium for adventitious bud induction: WPM+ 6-BA3.0mg/L 2-ip 1.0mg/L NAA0.1mg/L, the induction rate was 83.23%; The best medium for adventitious bud proliferation of MS +6-BA1.0mg/L NAA0.1mg/L GA30.5mg/L, the proliferation coefficient was 16, and the adventitious buds grew well; 1/2MS +IBA0.1mg/L NAA0.05mg/L was the best rooting medium, and the rooting rate was 92.35%. In the humus soil: Perlite =3:1 for transplanting survival rate was as high as 100%.

Chirita eburnean Hanc; Shoots induction; Medium

2016-04-10

贵州省科技厅推广项目“贵州野生草本花卉引种栽培示范”(编号：黔科合成字(2012)5033号资助)。

娄丽(1989～)，女，贵州贵阳，研实员，从事植物生物技术研究，E-mail:louli2007@163.com，联系电话：15286066085。

侯娜(1983～)，女，陕西户县人，工程师，从事林木生物技术研究，E-mail：houna1018@163.com，联系电话：18984309353。

S722.3+7

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