马尾松SRAP-PCR反应体系的建立及遗传多样性分析*

吴明长 徐嘉娟 朱亚艳 王 港

(1.黄平县国有林场 贵州黄平 556100；2.贵州省林业科学研究院 贵阳 550005)



马尾松SRAP-PCR反应体系的建立及遗传多样性分析*

吴明长1徐嘉娟2朱亚艳2王 港2

(1.黄平县国有林场 贵州黄平 556100；2.贵州省林业科学研究院 贵阳 550005)

利用相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记技术，对黄平县国有林场国家马尾松良种基地子代测定林中评选出的31个优良单株的遗传多样性和亲缘关系进行分析。从360对SRAP引物组合中筛选出7对条带清晰、多态性好的引物，在31份马尾松材料中共扩增出151条带，其中有150条多态性带，多态性比率99.3%；利用4对引物进行遗传多样性分析表明，31份马尾松材料间的遗传相似系数值变化范围为0.4239～0.8804，平均有效等位基因数为1.5679，Nei′s基因多样性指数为0.3304，Shannon信息指数为0.4956，说明31个优良单株间存在较高遗传变异。应用SRAP分子标记技术能有效地检测供试样本间的遗传多样性，揭示其亲缘关系，为贵州省高世代种子园营建亲本选配提供参考。

马尾松；遗传多样性；亲缘关系；SRAP

马尾松(PinusmassonianaLamb.)是我国南方重要的用材树种和荒山绿化的先锋树种，也是贵州主要的造林用材树种，目前马尾松遗传改良已步入高世代种子园营建阶段[1, 2]。种子园是林木良种繁育基地，要能提供遗传品质和播种品质优良的种子，保证种子园有较高的遗传增益，种子园的建立才有意义；同时又必须保证种子园有较宽的遗传基础，才能保证种子园的质量[3]。建园亲本的选配关系着种子园的成败，掌握建园材料的遗传背景和亲缘关系，对建园亲本的选配具有重要意义。高世代种子园的建园材料主要来源于上一代种子园的子代林，具有较大的几率出现半同胞家系甚至全同胞家系，如何配置由子代林中选出的无性系是当前我们建设高世代种子园面临的技术难点。

相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)标记是近年开发的一种新型分子标记技术[4, 5]。该标记方法扩增多态性高，能提供更多的生物学信息，检测的结果能更好的反映物种的遗传多样性和亲缘关系，并且其操作简便、成本低、可信度高、无需预先知道物种的序列信息[6～8]，是一个遗传多样性分析、亲缘关系研究、品种鉴定、种质资源研究的有效工具。近年来，利用分子生物学手段研究亲本间的亲缘关系与遗传差异，用以指导亲本选择、种质鉴定方面的应用已较为广泛[9～11]。沈敬理等[12]基于SSR和SRAP分子标记技术，构建了福建省漳平五一国有林场马尾松种子园131个亲本无性系的DNA指纹图谱。王鹏良等[13]采用SRAP分子标记对119份广西普通油茶进行遗传多样性分析，初步理清了供试材料间的遗传关系。胡德昌等[14]应用SRAP分子标记对24份桑树品种资源进行亲缘关系分析，筛选的SRAP引物能有效地检测供试桑树品种的遗传多样性，揭示品种间的亲缘关系。本研究利用SRAP分子标记对黄平马尾松种子园31个马尾松家系优选单株进行遗传多样性和亲缘关系分析，以期为黄平马尾松高世代种子园建园亲本选配提供分子水平的选择依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 材料

试验选取黄平县国有林场国家马尾松良种基地子代测定林中评选的31个优良单株进行测定分析，其中1号和3号、19号和21号为半同胞家系，12a号和12b号、19a号和19b号为全同胞家系，其它单株母本不同，父本不清楚。选取生长良好、无病虫害的嫩梢，剪下后放入装有硅胶的自封袋中，做好标记，待干燥好后放入-20℃冰箱中保存备用。

1.1.2 试剂及仪器

试验使用的试剂及厂家信息如下：2×Tap Master Mix购自上海欣百诺生物科技有限公司；100bp DNA Ladder(MD109)购自北京天根生化科技有限公司。

实验中使用的主要仪器有Long Gene A200型PCR仪(朗基公司生产)、DYY-12型电泳仪(北京六一公司生产)。实验在西北农林科技大学分子实验室完成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及筛选

参照Li等[4]提出的原则设计SRAP分子标记20个正向引物和18个反向引物，组合形成360对引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物名称及序列见表1。将合成的360对SRAP引物进行初筛，获得条带清晰稳定、扩增多态性好的7对引物用于分析。部分引物扩增结果见图1。

1.2.2 DNA提取及检测

采用改良的CTAB法提取马尾松基因组DNA，使用核酸蛋白分析仪检测DNA的浓度和纯度，用超纯水(ddH2O)将DNA样品浓度稀释为10 ng/μL，-20℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增体系及检验

SRAP-PCR反应体系(20μL)：模板DNA 1μL，正、反向引物各1μL，2×Tap Master Mix 10μL，dH2O 7μL。PCR扩增程序：95℃预变性1min；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，共5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测，并拍照记录。

表1 SRAP引物序列

图1 引物ME6/EM16对31份马尾松材料基因组DNA的PCR扩增产物电泳图

1.2.4 条带统计及遗传距离和遗传参数计算

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中同一水平位置条带有无对应赋值“1”、“0”的记录结果，利用NTSYS-pc 2.10e软件计算31份材料两两间的遗传相似性系数。遗传相似系数越大，表明供试材料间的亲缘关系越近，反之则越远[15]。首先对1号引物统计结果进行分析，然后再按引物编号顺序逐对添加数据，最终完成一对引物、两对引物……七对引物的分析。

1.3 可靠性检验设计

在采集供试马尾松材料时，分别选取2组全同胞和半同胞家系材料，用以检验试验结果的可靠性。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果分析

31个马尾松优良单株间的遗传变异相对较大。从360个引物组合中筛选出多态性好、条带清晰、重现性好的7对引物对31份马尾松材料DNA样品进行SRAP-PCR扩增。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测均有清晰的谱带，并显示丰富的多态性。7对引物组合共扩增出151条条带，其中150条为多态性条带，多态性比率为99.3%，每对引物组合平均扩增出21.6条条带和21.4条多态性条带(表2)。引物组合ME6/EM15、ME6/EM16、ME6/EM17产生的多态性比率均为100%，ME6/EM9引物组合的多态性最低也已超过90%。由此表明SRAP分子标记具有比较高的多态性，同时也说明31个马尾松优良单株间具有丰富的遗传多样性。图1是引物ME6/EM16对31份供试材料的扩增结果。

2.2 试验结果可靠性分析

通过对31份马尾松材料的聚类分析发现(图2)：12a和12b、19a和19b两组全同胞家系材料各自间具有最大的遗传相似性(0.880 4)而聚到一起；1和3、28和31两组半同胞家系各自间的遗传相似系数分别为0.8152、0.8370，遗传相似性较高，遗传距离较小，分别聚到同一个小分支上。聚类分析结果与可靠性检测设计的预期结果一致，表明本文试验结果是比较可靠的。

图2 31份马尾松材料基于SRAP分子标记的UPGMA聚类图

编号引物组合扩增条带总数/条多态性条带数/条多态性比率(%)1ME6/EM916159382ME6/EM1517171003ME6/EM1635351004ME6/EM1723231005ME6/EM715151006ME5/EM424241007ME4/OD82121100总和151150993

2.3 参试材料遗传多样性分析

供试样本遗传相似性系数见表3，从表中可以看出：随着引物对数的增多，遗传相似系数最小值逐渐增大，增加到4对引物数据后趋于平衡；最大值总体呈减小趋势，同样增加到4对引物数据后趋于平衡。三对、四对、五对引物数据的聚类图具有一定的相似性，6、9、10、11号样品与其他样品遗传相似系数较低，13、16、17、18、19、21号样品和23、24、28、29号样品等总是以较高的遗传相似性始终聚在一起。但相比之下，3对引物数据的聚类图与四对和五对引物数据的聚类图差异较大，将供试样本在0.7附件划分后，依据三对引物数据聚类图划分的居群中的样本与四对和五对引物数据聚类图划分的居群中的样本有较大出入，而依据四对引物数据的聚类图划分的居群则与依据五对引物数据聚类图划分的居群中样本成员完全一致，只是在更细层次的聚类中略有差异。因此采用4对引物数据(90个多态性位点)即可对供试的31份马尾松材料进行稳定、准确的聚类(图2)。

利用Popgene32软件对供试样本四对引物数据进行分析，得到31个马尾材料91个位点平均等位基因观察值(Na)为1.9890，平均有效等位基因数(Ne)为1.5679，Nei′s基因多样性指数(H)为 0.3304，Shannon信息指数(I)为0.4956。张薇[16]等通过SSR分子标记对福建白砂林场马尾松实生种子园家系及其自由授粉子代的遗传多样性分析表明：子代群体等位基因数平均为5.9167 个，有效等位基因数平均为2.3788 个，Shannon多样性指数为1.0348，Nei′s多样度为0.5740。张一等[17]利用ISSR分子标记对姥山林场马尾松二代核心育种群体的36个亲本无性系的分析发现供试样本的Nei's 基因多样性为0.328，Shannon信息多样性指数为0.476。

表3 引物遗传相似性系数表

2.4 不同亲缘关系材料遗传距离分析

2.4.1 全同胞单株遗传距离分析

遗传相似性分析结果表明所选取的两组全同胞家系：12a和12b、19a和19b，各自间具有最大的遗传相似系数0.8804，说明遗传相似性最高，遗传距离最小，亲缘关系最近，并且从聚类分析结果(图2)可以看到两组全同胞家系的材料分别聚在了一起。

2.4.2 半同胞单株遗传距离分析

对所选取的两组半同胞家系的遗传相似性分析表明， 1号和3号的遗传相似系数为0.8152，28号和31号遗传相似系数为0.8370，均具有较高的遗传相似性，遗传距离较小，亲缘关系比较近，在聚类分析(图2)时聚到了同一小分支上。

2.4.3 不同母本单株亲缘关系分析

31份马尾松材料的遗传相似系数为0.4239～0.8804(表4)，除两组全同胞家系和两组半同胞家系外，21号和19号、17号和19号的遗传相似系数较大，分别为0.8587、0.8478，遗传相似性较高，亲缘关系较近，推测21号、17号与19号同属于一个半同胞家系。而6号与30号的遗传相似系数最小，为0.4239，说明遗传相似性最低，遗传距离最大，亲缘关系最远。

表4 样品间的遗传相似系数

根据遗传相似性分析及聚类分析结果发现部分材料间的亲缘关系较近，在亲本选配时应配置到不同的区组中，避免长生近交，同时考虑在同一区组的亲本间亲缘关系不能太远，以免产生生殖隔离，影响种子园的产量和质量，据此将31个优良单株划分为3组：Ⅰ：1号、2号、12号、13号、16号、19号、22号、23号、24号、28号；Ⅱ：3号、4号、5号、14号、15号、17号、18号、20号、21号、29号、31号；Ⅲ：6号、7号、8号、9号、10号、11号、25号、26号、27号、30号，为高世代种子园建园亲本的选配提供分子生物学方面的参考。

3 讨论

本研究利用SRAP分子标记分析了黄平县国有林场国家马尾松良种基地计划作为基地高世代种子园建园材料的31个优良单株的遗传多样性，每对引物可以扩增出15～35条带，多态性水平为99.3%，表明该批材料具有比较宽的遗传基础，为马尾松高世代种子园的配置提供了丰富的遗传基础。

林木生长周期长、遗传背景复杂，在遗传改良过程中很难在短期内对亲本进行有效的评价和利用，因而增加了亲本选择的盲目性，限制了林木遗传改良的进程和效果。近年来，利用分子标记技术研究亲本间遗传差异与杂交子代性状表现的相关性，用以指导杂交亲本的选配成为林木遗传育种领域中的热点。张一等[18]利用ISSR分子标记研究发现，当马尾松一代育种亲本间的分子遗传距离处于0.264～0.529时，亲本间的遗传距离与其子代生长性状具有显著的相关性；李梅等[19]对杉木的研究表明，亲本的遗传距离在一定范围内与子代树高、胸径和材积性状呈显著正相关；李善文等[20]研究发现，杨树中随着父、母本间遗传距离的增大，子代生长的杂种优势更显著。当前我国马尾松遗传改良已经进入高世代育种阶段，收集保存的育种亲本所受的人工选择强度更大，遗传背景也更加复杂。因此，通过分子标记技术研究亲本遗传背景，辅助亲本选配和杂种优势预测，将对马尾松高世代育种中提高亲本选配效率和杂种优势利用具重要的意义。

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Establishment of SRAP-PCR Reaction System and Analysis of Genetic Diversity ofPinusmassoniana

WU Ming-chang1XU Jia-juan2ZHU Ya-yan2WANG Gang2

(1.Huangping County State-owned Forest Farm, Guizhou, Huangping 556100; 2.Guizhou Academy of Forestry, Guizhou, Guiyang 550005, China.)

The sequence-related amplified polymorphism (SRAP) was used for the analysis of genetic diversity and genetic relationship of 31 superior individuals selected from progeny test plantation in the national masson pine seeds base of state-owned forestry farm in Huangping county. Seven primer pairs with clear strips and good polymorphism was selected from 360 primer pairs,151 bands were amplified from 31 test materials, among which 150 bands were polymorphic, resulting in a polymorphic rate of 99.3%; 4 pairs of primer were used to analyze genetic diversity. The results showed that :the genetic similarity coefficients among 33 test materials ranged from 0.4239 to 0.8804, the average effective number of alleles was 1.5679, Nei′s gene diversity index was 0.3304, and Shanaon′s information index was 0.4956, which indicated that relatively higher genetic diversity exists between 31 superior individuals of Pinus massoniana. The genetic diversity and genetic relationship of test samples could be effectively revealed by SRAP marker technology, and the results would provide reference of parent selection in advanced generation seed orchard of Pinus massoniana.

Pinusmassoniana; genetic diversity; genetic relationships; SRAP

2016-04-22

吴明长(1974～)，助理工程师，主要从事马尾松良种基地研究与管理工作。Email:478759549@qq.com

，王港(1979～)，副研究员，主要从事林木遗传改良与苗木培育技术研究。Email:417328697@qq.com

“杉木、马尾松优良无性系选育及利用技术研究”(黔林科合 [2014] 04号)；马尾松种子园改造与高世代种子园建园材料研究(院立项目)。

S722.8+3

B