激光穴位照射对力竭运动大鼠骨骼肌SOD与MDA含量的影响

李芳杰，杨华元，王观涛

（上海中医药大学，上海201203）

激光穴位照射对力竭运动大鼠骨骼肌SOD与MDA含量的影响

李芳杰，杨华元，王观涛

（上海中医药大学，上海201203）

目的观察830 nm半导体激光穴位照射对力竭运动大鼠骨骼肌内SOD与MDA含量的影响。方法采用大鼠跑台下坡跑，进行力竭离心运动。将大鼠随机分为空白组（A组）、模型组（B组）、运动前半导体激光预照射组（C组）、运动后激光照射治疗组（D组）和运动前后激光照射联合组（E组），除空白组外，其余各组再分为24 h和48 h亚组，分别为B1组、B2组、C1组、C2组、D1组、D2组、E1组和E2组，每组8只。B组大鼠进行跑台一次性力竭运动；C组大鼠在力竭运动前激光预照射7 d，然后进行力竭运动；D组大鼠在运动后给予激光照射；E组大鼠在跑台运动前给予激光预照射7 d，运动后再给予激光照射治疗的联合照射。B1组、C1组、D1组和E1组在运动后24 h取材，B2组、C2组、D2组和E2组在运动后48 h取材。激光采用830 nm半导体激光发射器，穴位选取大鼠承山穴。观察各组治疗前后骨骼肌丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）的含量。结果B1组、D1组、B2组和C2组肌肉MDA含量与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。D2和E2组肌肉MDA含量与B2组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。B1组、C1组、D1组和B2组肌肉SOD含量与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。C2组、D2组和E2组肌肉SOD含量与B2组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论830 nm激光穴位照射能够恢复失衡的氧化还原反应。

激光针灸；半导体激光；力竭运动；丙二醛；超氧化物歧化酶；大鼠

运动性肌肉损伤（exercise-induced muscle damage，EIMD）在运动与训练中没有明显的疼痛感，仅表现为肌肉酸胀和僵硬，但在运动过后会出现延迟性的肌肉酸痛（delayed onset muscle soreness，DOMS）。Hough T［1］认为，出现DOMS不能认为它只是单纯的肌肉疲劳，而是伴有肌肉的损伤存在。他认为肌肉进行长时间、大运动量或不习惯的大量运动会导致疲劳伴随损伤的发生，也就是现在很多科研工作者提出的肌肉微损伤。一般认为DOMS能够自愈，但是这个过程持续时间较长，严重影响了常规的训练和比赛，还可能造成运动员其他方面的损伤，所以长期以来，DOMS一直是运动医学领域的研究热点。

低强度激光是指不会引起组织细胞的损伤，能对局部甚至全身起到刺激、调节和活化作用的小剂量激光［2］。其最大特点是直接照射生物组织时不会造成不可逆的损伤，反而能产生良性的生物刺激、应答反应以及光化学效应，进而调节机体的多种生理功能，例如神经冲动的传导、血液的各项功能、各种酶的活性、免疫及代谢等，通过改善和平衡这些功能以协调机体的各个系统进而达到治疗疾病的目的。

本研究是基于中医学针灸专业学科的特色内容结合运动医学领域研究热点及激光生物物理效应进行设计的，采用830 nm半导体激光的3种不同干预方法，探讨对肌肉组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量的影响，现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物

健康SD大鼠72只，8周龄，雄性，体重为（200± 32）g，由上海中医药大学动物实验中心提供。饲养动物室温温度为（24±2）℃，湿度为（45±5）%，适应性饲养1星期，按啮齿类动物国家标准饲料喂养，自由饮水。

1.2主要试剂与仪器

1.2.1主要试剂

丙二醛（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒及蛋白质试剂盒，均由基尔顿生物科技（上海）有限公司提供。

1.2.2主要实验仪器及设备

五跑道动物跑台（浙江杭州立泰科技有限公司）；830 nm半导体激光发光器（广东中山市飞线光电有限公司）；YJ82/1型双路直流稳压电源（上海沪光仪器厂）；高速离心机（德国Eppendorf公司产品）；移液器（吉尔森P型移液，Pipetman）；超低温冰箱（日本三洋公司）。

1.3动物分组及处理

表1　各组大鼠分组及干预情况

SD大鼠常规驯养1星期后，采用随机数字法分为空白组（A组）、模型组（B组）、运动前半导体激光预照射组（C组）、运动后激光照射治疗组（D组）和运动前后激光照射联合组（E组），除空白组外，其余各组再分为24 h和48 h亚组，分别为B1组、B2组、C1组、C2组、D1组、D2组、E1组和E2组，每组8只。大鼠分组及干预情况见表1。

1.4模型制备

参考Armstrong RB等［3］的运动模型，采用跑台下坡跑，进行一次性大运动量力竭离心运动。跑台速度每分钟16 m，坡度-16度，一直运动至力竭，在大鼠跑台运动整个过程中，用敲击声音和木筷刺激动物尾部，以使得大鼠能够始终在跑道的前部，保证了大鼠的运动强度（见图1）。当大鼠的速度不能与跑台一致，坐到或趴到跑道上乘电梯样动作3次，驱赶刺激无效，完全不再进行跑台运动，此时视为力竭。大鼠运动至力竭的时间为（180±60）min。空白组在饲养笼中自由活动。

图1　大鼠跑台下坡跑运动示意图

1.5选穴及激光照射方法

大鼠双侧承山穴。承山穴定位为大鼠后肢腘窝与跟骨连线的中点，约腓肠肌两肌腹交界的下端，取穴方法参照林文注主编的《实验针灸学》［4］及根据大鼠形态、生理特点及比较解剖学原理而定。将需要照射的大鼠在大鼠固定器内固定，将大鼠双侧腓肠肌处鼠毛用专用剃毛刀剃除，肢体固定，穴位定位，同时在双侧承山穴采用830 nm半导体激光发光器进行激光照射。输出波长为（830±5）nm，输出功率＜30 mW，光斑形状为圆形光班（直径2～3 mm）。照射时间为10 min，激光光束与皮肤直接接触。详见图2。

图2　大鼠双侧腓肠肌接受半导体激光穴位照射示意图

1.6动物取材和标本制备

力竭运动后24 h组大鼠在24 h节点取材，48 h组大鼠在48 h时间节点取材。迅速取右侧腓肠肌，在生理盐水中清洗，除去可见的结缔组织，用滤纸吸干水分，放入冻存管中，各组材料取完后一起转入-80℃超低温冰箱保存至检测。骨骼肌从-80℃冰箱取出解冻后，称取肌肉组织，加入生理盐水，按照W:v=1:9比值加入，在冰冻环境中将肌组织剪碎，再用研磨器将组织磨碎，用以制备成10%的匀浆，然后离心10 min，每分钟3500转，取出上清液，用来进行肌肉生化指标的检测。空白组以相同的方式与运动组一起进行处死、取材全过程。

1.7观察指标及检测方法

1.7.1肌肉MDA含量测定

大鼠腓肠肌中MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。TBA与DA缩合后能够形成红色产物，并且在532 nm处吸收峰最大，利用可见光分光光度计来对他的吸光度进行测定。肌肉MDA含量（nmol/mgprot）=（测定管吸光度值-测定空白管吸光度值）/（标准管吸光度值-标准空白管吸光度值）×标准品浓度/肌肉蛋白含量。

1.7.2肌肉SOD活性测定

大鼠腓肠肌中SOD含量测定采用黄嘌呤氧化酶法。本法是根据黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶进行一系列反应产生了超氧阴离子自由基，氧化羟胺成亚硝酸盐，最后由于显色剂而呈现出紫红色，再利用可见光分光光度计来测定他的吸光度。在样品中如果含有SOD，则可以抑制超氧阴离子自由基，从而达到亚硝酸盐减少的作用。在比色的时候就会出现测定管的吸光度值会低于对照管的吸光度值，最后再通过公式计算来求出样品中的SOD活性。肌肉SOD活性（U/mgprot）=（对照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度/50%×（反应总体积/取样量）/肌肉蛋白含量。其中SOD活性单位（U）是指每毫克组织蛋白在l mL的反应液中的SOD抑制率达50%时所对应的SOD量。

1.7.3肌肉蛋白含量测定

大鼠腓肠肌肌肉蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。考马斯亮蓝显色剂是呈棕红色的，当把它加入到样品中时，使得蛋白质分子上的-NH3基团与考马斯亮蓝染料上的阴离子结合，这时溶液就变为蓝色，再利用测定吸光度来计算出蛋白含量。蛋白含量=（测定管吸光度-空白管吸光度）×标准管吸光度/（标准管吸光度值-空白管吸光度值）。

实验中测得的肌肉SOD、MDAC数据均用肌肉蛋白含量进行修正。

1.8统计学方法

实验所有数据均采用SPSS21.0统计软件进行处理，使用数据探索SW算法进行正态分布检验，其中指标SOD数据满足正态分布，各组组间采用单因素方差分析进行差异性显著性检验，MDA指标数据不满足正态分布，采用非参数秩和检验法进行各组间的差异显著性检验，所有数据均以均数±标准差表示。数据插图采用Excel2003进行制作。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

由表1可见，B1组、D1组、B2组和C2组肌肉MDA含量与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。D2和E2组肌肉MDA含量与B2组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。B1组、C1组、D1组和B2组肌肉SOD含量与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。C2组、D2和E2组肌肉SOD含量与B2组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

表1　各组大鼠离心运动后肌肉MDA和SOD含量比较（x±s）

3　讨论

大鼠在8周龄时，性发育已成熟，相当于人类的青壮年时期，运动能力属于最强阶段，所以，非常适合我们实验运动强度的要求。大鼠腓肠肌为后肢的后群肌，属于抗重力肌肉群，在进行跑台下坡跑时，腓肠肌收缩是以离心收缩为主，且腓肠肌位置比较表浅，更易于接受低强度激光的照射，故本实验选取腓肠肌进行研究。

大鼠下坡跑造成的离心收缩模型更接近于人体DOMS的真实情况，故本实验选取该模型进行研究，在Amstrong的方案基础上通过延长运动的时间，以求更好地能诱导出动物的EIMD。通过观察肌组织HE染色结果、结蛋白阳性表达程度、检测血清CK、CK-MM活性等方法判断肌肉损伤的程度。在Amstrong模型中，大鼠运动的时间是90 min，但是动物在完成该负荷后，再给予额外的刺激时，动物还能继续进行跑台运动，说明疲劳的程度没有达到要求，要创建力竭性的运动模式，就需要更长的运动时间，更大的运动强度，所以本实验采取了坡度为-16度（为大鼠下坡跑不打滑的最大斜度），运动速度是16m/min，持续运动（180±60）min的改进方案，动物在运动后期表现出了非常明显的疲劳状态，从跑道中取出时已完全没有逃避的能力，表明本研究中的运动模式是一次性的力竭运动，符合EIMD造模的要求。

承山穴［5］是临床上常用穴位，属于足太阳膀胱经经穴，别名鱼腹、肉柱。人体上取穴在小腿后面正中，委中与昆仑之间，当足跟上提时，腓肠肌肌腹下出现三角形凹陷处。现代临床研究［6］证实，承山穴主要治疗小腿腓肠肌劳损及痉挛，配合其他穴位还可治疗其他疾病，如痔疾、肩关节周围炎等。穴位是人体脏腑经络之气输注并散发于体表的部位，是与脏腑经络之气相通并随之活动、变化的感受点和反应点。《内经》称穴位为“气穴”，是“脉气所发”和“神气之所游行出入”的部位。根据穴位的基本含义，穴位的功能主要表现在两个方面，即感受刺激和反映病证，基于以上认识本研究选取承山穴作为半导体激光照射刺激点。

自由基是指含有一个或多个未配对电子的分子、原子、或基团。对于自由基产生的机制，普遍认为，一是黄嘌呤氧化酶机制，即缺血缺氧时，ATP转化为ADP、AMP可转化成次黄嘌呤和黄嘌呤，在黄嘌呤氧化酶作用下，过氧化物阴离子自由基（O2-）被释放。二是线粒体机制，即线粒体细胞色素氧化酶是机体中多数氧耗发生部位。O2被呼吸链传递的4个电子还原，再与4个H+作用生成2H2O。但在这个过程中，会出现线粒体电子漏现象，少量电子被电子传递链“漏出”后，与氧直接结合后形成过氧化物阴离子自由基（O2-），运动使机体代谢增强，耗氧量增加，引发内源性自由基生成增加，自由基特别容易通过得失电子来进行各种各样的氧化还原反应过程，化学活性非常活泼，各种生物大分子都可以和它接触并发生一系列的反应，使得生物大分子在结构和功能等方面发生不同程度的变化［7］。在生理状态下，机体也会产生自由基，如活性氧，但这些自由基会被体内同时存在的清除系统及时清除，形成一个动态平衡来维持正常状态。在某种原因的作用下，打破了这个已有的平衡，那么在组织中会产生过强的脂质过氧化反应，使得机体不在正常状态。机体内不饱和脂肪酸大量存在，当受到过氧化反应时，会产生很多脂质过氧化物，这些物质有很大的细胞毒性。在机体内有两个脂质过氧化防御系统，一是包括SOD、CAT、GSH-PX、GSH-R、POD等的酶防御系统；二是包括GSH、维生素E、维生素A、辅酶Q等的非酶防御系统。在这两个防御系统的作用下，可以终止自由基的连锁反应。Davies KJ等［8］在1982年成功地找到了运动损伤可以使得机体自由基增多的直接证据，他借助当时新兴的电子自旋共振技术，检测到了电刺激后或是大强度跑后骨骼肌自由基的变化情况，之后的众多研究都表明急性大强度运动进行时机体自身清除自由基的能力不能够平衡在应激状况下产生的自由基，肌肉组织细胞内处于一个氧化应激的不平衡状态，从而引起细胞的变化和损伤。由于运动可以引发内源性自由基生成增加，所以我们认为自由基与运动性肌肉损伤有关。

MDA是不饱和脂肪酸与自由基发生反应后的一系列代谢产物，它的检测可以间接地反映体内自由基水平。曹国华等［9］报道人体在急性有氧运动后血中MDA含量增加。Brady PS等［10］研究发现动物在急性大量运动后肌肉、血浆、肝脏的MDA含量增加，还有报道运动后MDA下降的情况出现，在倪耀华［11］的研究中，他让8名男生在功率自行车上以30%VO2MAX强度一直运动到力竭，检测血中MDA含量，发现与安静时相比有显著增多，以90%VO2MAX强度一直运动至力竭，通过检测没有发现MDA有显著变化，运动强度和组织的特异性有可能会影响它的变化，那么从以往众多研究结果来看，急性大强度的力竭性运动在一般情况下更容易引起MDA含量增加，运动后肌肉组织中的MDA变化敏感。本研究试验结果表明，大鼠力竭运动后，模型组大鼠在24 h与48 h节点肌肉中MDA含量增高，其中48 h更显著。3个激光干预组在24 h节点只有后照射组含量显著升高，但在48 h节点时，后照射组与联合照射组效果显著，显著低于模型组水平，而预照射组虽然含量也趋于下降水平，但与模型组没有显著性差异。所以我们认为联合照射组与后照射组在抑制肌肉组织中MDA含量升高有显著影响。

活性氧生成过程中，初始产物是超氧阴离子，SOD是活性氧防御的第一线，它含有Cu和Zn离子，能够将超氧阴离子歧化为H2O2和H20，虽然H2O2仍是有害的活性氧，但是体内的过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）可以把它分解为完全无害的水。研究［12-13］表明，SOD的活性受到细胞内pH值和H2O2浓度的影响，过低的pH值或过高浓度的H2O2可以抑制SOD的活性。在本实验中力竭运动不仅在细胞内产生大量的酸性产物，pH值变低，使SOD分子中的组氨酸-61残基发生质子化，运动消耗了大量的还原型谷胱甘肽，不能及时清除H2O2，可使SOD分子中的CU2+还原CU+，SOD由此而失活导致SOD活性下降。

830 nm半导体激光可影响自由基的生成与清除，既能够通过抗氧化酶活性的提高来加速自由基的清除，又能够减少自由基的产生。线粒体内的细胞色素c、b等光敏物质吸收光束，加强了电子传递链的藕合作用，使得电子传递增强，线粒体功能得以改善，同时可以抑制炎性细胞的呼吸爆发，最终产生的活性氧自由基减少，同时激光使组氨酸残基去质子化，恢复SOD分子中Cu和Zn之间的咪唑桥连接，从而重新激活SOD。再者，激光还能提高CAT和POD的活性，加速对H2O2的清除，解除其对SOD活性的抑制，对于抑制SOD下降有显著影响［12-13］。本研究结果显示，运动后进行激光穴位照射，能够更快地消除由于运动产生的大量自由基及其代谢产物，使得失衡的氧化与抗氧化系统更快地趋于平衡。

［1］Hough T.Ergographic studies in muscular fatigue and soreness［J］.J Boston Soc Med Sci，1900，5（3）:81-92.

［2］Bjordal JM，Lopes-Martins RA，Iversen VV.A randomised，placebo controlled trial of low level laser therapy for activated Achilles tendinitiswithmicrodialysismeasurementofperitendinous prostaglandin E2 concentrations［J］.Br J Sports Med，2006，40（1）:76 -80.

［3］Armstrong RB，Ogilvie RW，Schwane JA.Eccentric exercise -induced injury to rat skeletal muscle［J］.J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol，1983，54（l）:80-93.

［4］林文注，王佩.实验针灸学［M］.上海:上海科学技术出版社，1999: 288.

［5］胡玲.经络腧穴学［M］.上海:上海科学技术出版社，2009:128-129.

［6］刘书坤，李志刚.承山穴的临床应用举隅［J］.针灸临床杂志，2008，24（5）:31-32.

［7］Ward PA，Warren JS，Johnson KJ.Oxygen radicals，inflammation，and tissue injury［J］.Free Radic Biol Med，1988，5（5-6）:403-408.

［8］Davies KJ，Quintanilha AT，Brooks GA，et al.Free radicals and tissue damage produced by exercise［J］.Biochem Biophys Res Commun，1982，107（4）:1198-1205.

［9］曹国华，陈吉棣.运动、锌铜营养与自由基代谢Ⅱ.一次急性有氧或无氧运动对人体内自由基生成与清除的影响［J］.中国运动医学杂志，1991，10（1）:1-3，62.

［10］Brady PS，Brady LJ，Ullrey DE.Selenium，vitamin E and the response to swimming stress in the rat［J］.J Nutr，1979，109（6）:1103-1109.

［11］倪耀华.运动强度对血浆脂质过氧化物和超氧化物歧化酶活性的影响［J］.中国运动医学杂志，1992，11（2）:118-122.

［12］Bray RC，Cockle SA，Fielden EM，et al.Reduction and inactivation of superoxide dismutase by hydrogen peroxide［J］.Biochem J，1974，139（1）:43-48.

［13］Ricciardolo FL.Multiple roles of nitric oxide in the airways［J］.Thorax，2003，58（2）:175-182.

Effect of Acupoint 830 nm Laser Irradiation on Skeletal Muscle SOD and MDA Contents in Exhaustive Exercise Rats

LI Fang-jie，YANG Hua-yuan，WANG Guan-tao.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China

ObjectiveTo investigate the effect of acupoint 830 nm semiconductor laser irradiation on skeletal muscle SOD and MDA contents in exhaustive exercise rats.MethodsRats did exhaustive eccentric exercise by downhill treadmill running.Rats were randomized into a blank group（group A），a model group（group B），a pre-exercise semiconductor laser pre-irradiation group（group C），a post-exercise laser irradiation group（group D）and a pre-and post-exercise laser irradiation combination group（group E）.Except the blank group，each of the other groups was again divided into 24 h and 48 h subgroups，and there were groups B1，B2，C1，C2，D1，D2，E1 and E2，8 rats each.Group B rats did one exhaustive exercise by treadmill running.Group C rats

laser pre-irradiation for 7 days before they did exhaustive exercise.Group D rats

laser irradiation after the exercise.Group E rats

laser pre-irradiation for 7 days before treadmill running and combined laser irradiation after the exercise.Specimens were taken in groups B1，C1，D1 and E1 at 24 h after the exercise and in groups B2，C2，D2 and E2 at 48 h after the exercise.A 830 nm semiconductor laser transmitter was used for laser irradiation.Point Chengshan was selected in the rats.Skeletal muscle superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）contents were measured in every group before and after treatment.ResultsThere was a statistically significant difference in muscular MDA content between group B1，D1，B2 or C2 and group A（P＜0.05）and between group D2 or E2 and group B2（P＜0.05）.There was a statistically significant difference in muscular SOD content between group B1，C1，D1 or B2 and group A（P＜0.05）and between group C2，D2 or E2 and group B2（P＜0.05）.ConclusionAcupoint 830 nm semiconductor laser irradiation can restore unbalanced oxidation-reduction reactions.

Laser acupuncture；Semiconductor laser；Exhaustive exercise；Malondialdehyde；Superoxide dismutase；Rats

加

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0085

1005-0957（2016）01-0085-05

国家科技支撑计划项目（2012BAI25B03）

李芳杰（1982-），女，博士

杨华元（1952-），男，教授，博士生导师

2015-08-12