针刺对睡眠剥夺大鼠学习记忆功能及前额叶皮质BDNF表达的影响

翟佳丽，陈　松，田家星，张旭东，刘　欢，刘川东，赵光涛

（滨州医学院，烟台 264003）

针刺对睡眠剥夺大鼠学习记忆功能及前额叶皮质BDNF表达的影响

翟佳丽，陈松，田家星，张旭东，刘欢，刘川东，赵光涛

（滨州医学院，烟台 264003）

目的观察针刺对睡眠剥夺（SD）大鼠学习记忆功能及前额叶皮质BDNF表达的影响，为针刺疗法用于临床治疗SD提供理论依据。方法将60只大鼠随机分为对照组、模型组和针刺组，每组20只。模型组大鼠通过水上站立法建立SD大鼠模型，针刺组通过针刺神门穴进行干预治疗，对照组大鼠不做任何处理。分别于SD24 h、72 h后利用Morris水迷宫方法检测各组大鼠学习记忆功能，然后处死取脑，通过免疫组化方法检测大鼠前额叶皮质BDNF表达量的变化。结果针刺组和模型组SD24 h、72 h后体重、定位航行时间、空间搜索实验结果及前额叶皮质内BDNF表达量与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。针刺组SD24 h、72 h后定位航行时间和空间搜索实验结果与模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。针刺组SD72 h后体重及前额叶皮质内BDNF表达量与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论针刺可明显改善SD导致大鼠学习记忆功能下降，并可改善大鼠前额叶皮质因SD导致的BDNF表达下降。

针刺；睡眠剥夺；穴，神门；学习记忆功能；BDNF；大鼠

睡眠与人类每一项生理活动息息相关，其生理重要性与呼吸及心跳相等。睡眠能促进个体的生长发育，并具有易化学习、形成和维持记忆的功能。近年来，越来越多的动物和临床实验［1-3］表明，睡眠在学习、记忆进程中发挥了重要作用。睡眠剥夺（sleep deprivation， SD）指由于各种原因引起的睡眠丢失状态，可引起情绪、学习记忆、免疫功能等一系列改变［4］。有研究［5］显示，SD超过20 h即可导致机体认知及学习记忆功能下降。若长期处于SD状态，则会引起机体生理及心理状态的改变。因此针对SD进行有效治疗方法的开发是目前临床研究的重点。

针刺是目前对各种病症非常有效的治疗方法之一，因其无副反应、见效快而被广泛应用。本研究拟通过水上平台法建立SD大鼠模型，然后选取神门穴进行针刺治疗，通过Morris水迷宫检测针刺对SD大鼠学习记忆功能的改善，以期研究开发针对SD的安全有效的临床治疗方法，并通过免疫组化方法检测大鼠前额叶皮质BDNF表达变化，为SD发生机制及针刺治疗机制的阐述提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验动物

成年雌性Wistar大鼠60只，体重为180～220 g，购自山东大学实验动物中心［实验动物生产合格证号SCXK（鲁）20080002］。

1.2实验仪器与试剂

兔抗大鼠BDNF单克隆抗体（北京博奥森公司）；睡眠剥夺箱（自制）；一次性针刺针（苏州医疗用品厂有限公司）；Morris水迷宫实验系统（北京智多宝生物技术有限公司）；石蜡切片机（德国莱卡）；显微镜（德国莱卡）。

1.3动物分组及处理

将60只大鼠随机分为正常组、模型组和针刺组，每组20只。模型组根据文献采用改良多平台睡眠剥夺法（MMPM）建立睡眠剥夺模型。自制睡眠剥夺鼠箱（110 cm×60 cm×40 cm），10个直径6.5 cm、高8.0 cm的平台，平台间隔15 cm，在平台周边注满水，水温保持在22℃，水面距平台面约1.0 cm，鼠在平台上可自行摄食饮水，并在平台上活动。当大鼠进入REM睡眠时，由于全身肌肉张力降低，导致躯体失衡而触水惊醒，确保大鼠不能进入REM睡眠期。针刺组大鼠于实验前1星期开始针刺。取神门穴，穴位位于大鼠前肢内侧腕部横纹尺骨边缘。直刺1 mm，行平补平泻，留针40 min，针刺时间为每日申时（下午15:00—17:00），直至实验结束。对照组不作任何处理。

1.4Morris水迷宫训练

采用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆功能。各组大鼠于实验前4 d开始水迷宫训练。每日4次，时间为上午9:00—10:00，下午15:00—16:00。每个时间段训练2次，每只大鼠训练间隔为30 s，并对其逃避潜伏期（从入水至找到安全平台的时间）进行记录，测试时限定为60 s。水池上空架设1台摄像机，通过与监视器和计算机相连，水迷宫检测软件系统即会对大鼠进入水池内的运动轨迹和运动时间进行自动跟踪及记录。实验训练结束后即开始对模型组及针刺组大鼠进行SD，分别SD24 h、72 h后对各组大鼠进行学习行为学测试。实验检测项目为定位航行实验和空间搜索实验。检测时分别将大鼠面向池壁从4个入水点放入水池，并将大鼠从入水到至找到水下隐蔽平台并站立于其上所用时间进行记录，作为潜伏期，用s表示，大鼠找到平台后，让其在平台上站立10 s，同时将大鼠运动轨迹进行记录，观察各组大鼠找寻平台运动轨迹规律。

1.5免疫组化

采用免疫组化方法检测大鼠前额叶皮质BDNF表达变化。水迷宫检测结束后各组随机取10只大鼠，全身灌注，取脑，固定于4%多聚甲醛，然后石蜡包埋，制作石蜡切片，切片厚度为5 μm。将石蜡切片常规脱水至蒸馏水，微波法抗原修复（修复条件为微波火力中档，10 min，抗原修复液为EDTA），PBS洗3次，每次3 min；滴加3%双氧水-甲醇液，完全覆盖组织，湿盒内室温孵育10 min，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加非免疫动物血清，完全覆盖组织，湿盒内室温孵育20 min，甩去非免疫动物血清，不洗，滴加一抗（PBS稀释，l:100），需完全覆盖待检组织，湿盒内4℃孵育过夜；PBS洗3次，每次3 min；滴二抗工作液，完全覆盖组织，湿盒内室温孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；滴辣根酶标记链霉素卵白素工作液完全覆盖组织，湿盒内室温孵育10 min；PBS洗3次，每次3 min；显色剂显色:每张切片滴加新鲜配制的DAB工作液完全覆盖组织，显微镜下掌握显色程度，自来水充分冲洗，清除残余显色剂，苏木素复染5 min，自来水冲洗5 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，染色时设阴性对照，一抗用PBS代替，其它步骤相同。对免疫组织化学染色结果进行图像分析，每组动物选取3张切片，每张切片选取的位置尽量一致，同一部位选取3个视野，通过Imagep-Pro Plus6.0对图像进行累积吸光度值分析。

1.6统计学方法

所有数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，治疗前后采用配对t检验，组间比较采用方差分析；计数资料采用卡方检验。

2　实验结果

2.13组大鼠外观状态比较

3组大鼠在SD前皮毛顺滑，有光泽，动作灵敏，精神正常，无倦怠表现，进食饮水正常；模型组大鼠SD24 h后皮毛开始出现倒竖，光泽降低，出现倦怠表现，进食饮水减少；SD72 h后皮毛无光泽，且倒竖现象严重，在平台上站立不稳，进食饮水明显减少，动作迟缓，倦怠异常。针刺组大鼠皮毛光泽下降，出现倒竖现象，外观与模型组差别不明显。对照组大鼠在24 h和72 h时外观并无较大变化。

表1　3组大鼠SD前后体重比较　（x±s，g）

由表1可见，3组大鼠SD前体重比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。针刺组和模型组SD24 h、72 h后体重与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。针刺组SD72 h后体重与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.005）。

2.23组大鼠SD前后定位航行时间比较

定位航行实验用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。实验观察和记录大鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间，即记录其潜伏期。

由表2、图1可见，3组大鼠SD前定位航行时间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。针刺组和模型组SD24 h、72h后定位航行时间与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。针刺组SD244 h、72 h后定位航行时间与模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

表22　3组大鼠SD 前后定位航行时间比较（x±s，s）

图1　3组大鼠定位航行结果示意图

2.33组SDD前后空间搜索实验结果比较

空间搜索实验用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。定位航行实验结束后，撤去平台，记录大鼠120s内穿过原平台位置的次数和在原平台象限探索时间占总时间的百分比。

由表3可见，3组大鼠SD前空间搜索实验结果比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。针刺组和模型组SD24 h、72h后空间搜索实验结果与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。针刺组SD24 h、72 h后空间搜索实验结果与模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜00.05）。

表3　3组SD 前后空间搜索实验结果比较　（x±s，%）

2.4免疫组化检测3组大鼠前额叶皮质BDNF表达结果

由表4、图2可见，针刺组和模型组SD24 h、72 h后前额叶皮质内BDNF表达量与对照组比较，差异均具有统计学意义（PP＜0.05）。针刺组SD72 hh后前额叶皮质内BDNF表达量与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表44　3组大鼠前额叶皮质BDNFF 相对表达量比较（x±s，IOD）

4　讨论

目前SD最好的治疗方法为令其睡眠。药物治疗选择的药物主要为中枢兴奋药，这类药物多为精神药物，依赖性、耐受性等副反应较大［6］。因此探索一种安全有效、无副反应、不易复发的治疗方法成为目前国内外研究的热点。

神门穴为手少阴心经原穴，具有宁心安神的功能，临床常用于治疗失眠、健忘等症状。有研究［7］报道，通过针刺神门等穴，配合心理疗法治疗飞行员睡眠障碍67例，结果治愈52例，治愈率为77.6%。

图2　各组大鼠前额叶皮质BDNF免疫组化染色（×400）结果

Morris水迷宫是在1986年由Moorris等设计，用于测试大鼠的空间学习能力，现被广泛使用［8］。SD可导致机体接受和语言表达、记忆以及复杂的口头算数等能力下降［9］。叶晨静等［10］研究发现SD可导致大鼠出现反应次数的错误逐渐增加，在恢复一定时间的睡眠后，错误反应出现的次数渐渐下降，可见SSD可以影响动物的学习记忆能力。刘国龙等［11］建立睡眠剥夺大鼠模型后，利用Morrris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力，发现睡眠剥夺组大鼠的逃避潜伏期延长，穿过原平台位置次数和在原平台象限探索时间百分率下降（P＜0.05）。本研究Morris水迷宫实验中定位航行及空间搜索结果显示睡眠剥夺可导致大鼠空间学习记忆功能下降，而针刺神门穴进行干预治疗后可改善大鼠学习记忆功能。

学习记忆是脑的高级功能之一，涉及多个脑区，其中前额叶皮质是参与了学习记忆功能的重要脑区［12］，同时众多研究表明BDNF与大鼠的学习记忆能力有密切的关系［13］，BDNF可改善大鼠学习记忆能力作用主要通过增加海马和大脑皮层NNMDAR受体亚单位NR1和NR22B的磷酸化水平，进而诱导LTTP形成和维持，并可增加神经元数目或突触数目，调节突触可塑性，影响学习记忆功能。本研究发现模型组大鼠在SD24 hh后BDNF表达呈升高趋势，而在SD72 h后则迅速下降，可见在SD24 h后机体可能通过增加BDNF的表达来做出相应的应激保护反应，在SD72h后表达迅速下降则表明长期睡眠剥夺有可能超出了机体自我调节范围，结合Morris水迷宫结果可以看出大鼠学习记忆功能在睡眠剥夺后迅速下降；针刺组大鼠在进行干预治疗后，其前额叶皮质 BDNNF表达明显高于模型组，而在SD72 h后则呈现表达下降，但仍高于模型组，结合Morrris水迷宫结果可看出针刺可以改善大鼠学习记忆功能，而其作用可能是通过促进前额叶皮质BDNFF表 达而改善突触可塑性实现。

［1］Homung OP, RRegen F, Danker--HoPfe H, et al.The relationshipp between REM slleep and memoryconsolidation in oold age and effectss of cholinergic medication[J]. BiolPsyehiatry, 2007，61（6）:750-757.

［2］Ishikawa A, KKanayama Y, Mattsumura H, et all. Selective rapidd eye movementsleep deprivationimpairs the mainntenance of long--term potentiationn in the rat hippoccampus[J]. Eur J NNeurosci, 2006，244（1）:243-248.

［3］Dang-Vu TT, Deesseilles M, Peigneeux P, et al. A rolee for sleep in brainn plasticity[J]. Peddiatr Rehabil, 20066，9（2）:98-118.

［4］Deaconson TF,O’Hair DP, Levyy MF, et al. Sleepp deprivation andd resident performmance[J]. JAMA, 19988，260（12）:17221-1727.

［5］Li S, Tian Y, Ding Y, et al. The eeffects of rapid eye movement sleepp deprivation andrecovery on sppaatial reference mmemory of youngg rats[J]. Learn Beehav, 2009，37（3）::246-253.

［6］范新六，李峰，宋月晗，等.加味四逆散对异相睡眠剥夺大鼠前额叶皮质突触可塑性改变的研究［J］］.中国实验方剂学杂志，2011，111（19）:150-152.

［7］尤阳.针灸配合心理疗法治疗飞行员睡眠障碍67例［J］.中国疗养医学，2000，9（6）:48.

［8］Morris RG, Andderson E, Lynch GGS, et al. Selectiive impairment off learning and bloockade of long-terrm potentiation byy an N-methyl-D--aspartate receptoor antagonist, AP55[J]. Nature, 1986，319（6056）:774--776.

［9］Zerouali Y, Jemel B, Godbout R.The effects of eaarly and late nightt partial sleep deprivation on autommaatic and selectiveattention: An ERPP study[J]. Brain RRes, 2010，1308:877-99.

［10］叶晨静，赵忠新.快速眼球转动期睡眠剥夺对大鼠学习、记忆能力及其海马组织脑源性神经营养因子表达的影响［JJ］.第二军医大学学报，2007，28（1）:82-86.

［11］刘国龙，赵明亮，万子兵，等.睡眠剥夺对大鼠空间学习记忆的影响及其LTP机制的研究［J］.第三军医大学学报，22006，28（6）:569--572.

［12］谢敏，徐波，王泽军.游泳训练对大鼠空间学习记忆能力与海马、前额叶皮质环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷水平的影响［JJ］.中国康复医学杂志，2009，24（11）:1002.

［13］Bramham CR, MMessaoudi E. BDNNF function in addult synaptic plas--ticity: the synapttic consolidation hhypothesis[J]. Progg Neurobiol, 20055， 76（2）:99-125.

Influence of Acupuncture on Learning and Memorial Function and the Expression of BDNF in Prefrontal Cortex of Rats with Sleep Deprivation

ZHAI Jia-li, CHEN Song, TIAN Jia-xing, ZHANG Xu-dong, LIU Huan, LIU Chuan-dong, ZHAO Guang-tao.Binzhou Medical College,Yantai 264003,China

ObjectiveTo investigate the influence of acupuncture on learning and memorial function and the expression of BDNF in prefrontal cortex of rats with sleep deprivation (SD), for providing theoretical evidence for treating sleep deprivation with acupuncture. MethodSixty Wistar rats were randomly divided into a control group, a model group, and an acupuncture group, 20 rats in each group. SD models were established by the modified multiple platform methods; the acupuncture group was intervened by acupuncture at Shenmen (HT 7); while the control group was left intact. Respectively after SD for 24 h and 72 h, the learning and memorial function was tested by using Morris water maze. Ten the rats were sacrificed to collect brain for detecting the expression of BDNF in prefrontal cortex via immunohistochemical method. ResultThe body weight, learning and memorial function, and the expression of BDNF in prefrontal cortex of the acupuncture group and model group were significantly different from those of the control group after SD for 24 h and 72 h (P＜0.05). The learning and memorial function of the acupuncture group was significantly different from that of the model group after SD for 24 h and 72 h (P＜0.05). The body weight and expression of BDNF in prefrontal cortex of the acupuncture group were significantly different from those of the model group after SD for 72 h (P＜0.05). ConclusionAcupuncture can obviously improve the decline of the function of learning and memory of the SD rats, and also up-regulate the declined expression of BDNF in prefrontal cortex caused by SD.

Acupuncture; Sleep deprivation; Point, Shenmen (HT 7); Learning and memorial function; BDNF; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0094

1005-0957（2016）01-0094-04

滨州医学院大学生科技创新活动基金（BY2013DKCX082）

翟佳丽（1984 - ），女，讲师

赵光涛（1984 - ），男，实验师，Email:zgt2727@sina.com

2015-09-28