水貂出血性肺炎灭活疫苗（B型）生产工艺的建立

杨朋欣 丁国杰 刘可姝 张春媛 王彬/哈药集团生物疫苗有限公司

水貂出血性肺炎灭活疫苗（B型）生产工艺的建立

杨朋欣 丁国杰 刘可姝 张春媛 王彬/哈药集团生物疫苗有限公司

水貂出血性肺炎是由绿脓杆菌（又称铜绿假单胞菌，Pseudomonas aeruginosa）感染引起的一种高度致死性传染病，多发于每年9至11月份，该菌可通过患病水貂形成的飞沫及气溶胶传播。发病急、死亡快，所以又称铜绿假单胞菌肺炎，以呼吸困难、口鼻出血、突发性死亡为主要特征，死后典型症状为口鼻流出血样泡沫，剖检肺脏呈弥漫性出血。

一般对该病的控制采取抗生素治疗，但该方法易产生耐药性，因此疫苗的制备是控制该病较好的手段，本研究对B型绿脓杆菌疫苗制备生产工艺进行优化，获得安全、免疫效力良好的灭活产品，为水貂多价疫苗和联苗产品的制备提供理论依据。

一、材料

1.菌株。水貂绿脓杆菌血清B型SD004株由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心保存。

2.主要试剂及仪器。甲醛溶液和NaCl均购自国药集团；LB和TSB均购自OXOID；发酵罐购自福州福尔流体设备有限公司。

二、方法

（一）一级种子的繁殖

还原绿脓杆菌B型SD004株冻干菌种，划线接种含5%牛血清肉汤琼脂平板，37℃培养过夜，挑取单个典型菌落，接种5.0 ml含5%牛血清肉汤培养基，37℃，180 r/min，培养16 h，经纯检合格后，作为一级种子。

（二）二级种子的繁殖

将检验合格的一级种子按培养基总量的1%接种含5%牛血清肉汤培养基，37℃ 180 r/min，培养16 h，经纯粹检验合格后，作为二级种子。

（三）发酵培养时间优化

将各生产用菌种按培养液总量的1%接种TSB，生物发酵罐进行培养，37℃通气培养24 h，自第6 h开始，每2 h收获菌液，按此工艺平行3次，其搅拌速度为180 r/min，取样并进行活菌计数，取三次试验结果的平均值，分别绘制该菌各血清型的生长曲线。

（四）灭活工艺优化

将制备好的水貂绿脓杆菌浓缩菌液分为成5组，分别加入终浓度为0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的甲醛溶液，同时设未灭活对照，37℃灭活24 h，60 r/h，分别于第12、14、16、18、20、22和24小时取样进行灭活检验。

（五）安全性试验

按照优化后的生产工艺制备疫苗分别进行对非靶动物安全性试验，对靶动物单剂量和超剂量安全性试验。

1.对非靶动物的安全性试验。疫苗腹腔接种5只18～20 g小鼠，0.3 ml/只，另5只作为对照，接种后观察14日，记录小鼠局部及全身反应情况。

2.靶动物单剂量和超剂量免疫安全性试验。选取15只2月龄水貂，随机分为3组，5只/组，分别进行免疫，单剂量组1.0 ml/只，超剂量组2.0 ml/只，另5只为对照。免疫后观察14日，记录水貂局部及全身反应情况。

（六）效力试验

1.对水貂的效力试验。取2～5月龄健康易感水貂10只，随机分为2组，每组5只。第1组水貂皮下注射疫苗1.0 ml/只；第2组水貂不免疫作为对照。免后21日，两组水貂分别滴鼻接种10LD50的SD004株菌液0.2 ml，攻毒后观察7日。对照组水貂应全部死亡，免疫 组水貂应至少保护4只。

2.对小鼠的效力试验。取体重18～20 g清洁级昆明小鼠20只，随机分为 2组，每组10只。第1组小鼠各腹腔注射疫苗0.3 ml；第2组小鼠不免疫作为对照。免后21日，两组小鼠分别滴鼻接种10LD50的SD004株菌液0.1ml，攻毒后观察7日。对照组小鼠应全部死亡，免疫组小鼠应至少保护8只。

三、结果

（一）发酵罐培养时间优化结果

培养B型菌液，以活菌计数对数为纵坐标绘制的生长曲线结果如图1所示，在相同条件下，菌株在14～16 h培养范围内细菌存活数为高峰，考虑实际操作最佳培养时间为16 h。

（二）灭活工艺优化结果

通过对灭活工艺进行优化，根据最终制备疫苗的甲醛含量，同时结合选择甲醛浓度的灭活效果，结果如表1所示，37℃条件下，选择按菌液总量的0.3%加入甲醛溶液，灭活24 h最为适合，能够保证灭活效果。

表1　 37℃不同甲醛浓度下水貂绿脓杆菌的灭活效果

四、疫苗的安全性试验结果

（一）疫苗对非靶动物的安全试验结果

疫苗对小鼠的安全性试验结果见表5，在观察期内小鼠全部健活，临床表现正常、免疫局部和全身无不良反应。

（二）最小使用日龄靶动物单剂量免疫的安全试验结果

疫苗对最小使用日龄靶动物单剂量免疫安全性试验结果见表3，单剂量接种2月龄水貂后，在观察期内水貂全部健活，临床表现均正常、注射局部和全身无不良反应，全部存活。

（三）靶动物一次超剂量免疫安全性试验结果

疫苗对靶动物一次超剂量免疫安全性试验结果见表4。超剂量接种2月龄水貂后，在观察期内水貂全部健活，临床表现正常、免疫局部和全身无不良反应，全部存活。

（四）疫苗的效力试验结果

1.对水貂的效力试验结果。B型灭活疫苗免后21日攻毒，疫苗免疫组水貂保护率为5/5，对照组水貂全部死亡（表5）。

2.对小鼠的效力试验结果。免后21日攻毒，三批疫苗免疫组小鼠保护率为9/10，对照组小鼠全部死亡（表6）。

表2　 对小鼠的安全性试验临床观察结果

表3　 对水貂最小使用日龄单剂量免疫安全性试验临床观察结果

表4　 靶动物一次超剂量免疫安全性试验临床观察结果

表5　 对水貂的免疫效力试验结果

表6　 对小鼠的免疫效力试验结果

五、讨论

中国于上世纪80年代初首次报道了水貂出血性肺炎病例，此后相继有该病报道，调查发现中国各地水貂出血性肺炎B型菌株流行情况为8%～50%不等，由于各血清型之间无交叉保护，制备的单苗具有针对性。因此，研制一种防治水貂出血性肺炎的安全性好、保护效力高的灭活疫苗具有重要的现实意义，本试验通过对制苗工艺的优化获得安全免疫效力较好的疫苗，在灭活时间上22 h也可以，但考虑到生产风险等因素，选择更为稳定的24 h。

（略）