丹参酮-丹酚酸-三七总皂苷均衡缓释给药系统的研究

张秋燕　李　娜　崔翰明.中国中医科学院广安门医院中药研发中心，北京00053；.扬子江药业集团南京中药所，江苏南京0049

丹参酮-丹酚酸-三七总皂苷均衡缓释给药系统的研究

张秋燕1李娜2崔翰明1
1.中国中医科学院广安门医院中药研发中心，北京100053；2.扬子江药业集团南京中药所，江苏南京210049

目的研制一种能实现丹参-三七多组分同步均衡缓释给药的系统。方法分别采用骨架溶蚀、固体分散体、脂质体和膜包衣控释技术将总丹酚酸、总丹参酮和三七总皂苷制成具有不同释药特性的微丸，根据其释药速度（速释、迟释和缓释微丸）将不同组分微丸进行组合，计算相似因子（f2），选择释药曲线相似度较高者进行多成分组合，并与普通胶囊对比，实现12 h内同步均衡缓慢释放的组合方式。结果丹酚酸、丹参酮和三七总皂苷的速释丸∶迟释丸∶缓释丸组合比例分别为1∶3∶2、1∶1∶2、2∶3∶5时，丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹酚酸B的释放f2为52.00，四种三七皂苷和丹酚酸B的释放相似因子为60.96，丹参酮ⅡA、隐丹参酮和三七总皂苷的释放相似因子为57.13，各有效组分的释药曲线相似性较高，释药速率较普通胶囊明显减缓，可实现不同组分同步均衡缓慢释放的设想。结论应用多元微丸释药系统将性质差异较大的多类组分分别制成具有不同释药特性的微丸，并按一定方式组合，可实现多组分同步均衡缓慢释放，为多种不同组分提供一种实现缓释的新方法。

丹参总酚酸；总丹参酮；三七总皂苷；同步均衡释药系统；缓控释

中药成分复杂，不同成分的理化性质和生物药剂学性质存在明显差异，多组分多性质促使中药多元释药系统的开发，其包含多个组分释药单元，能够达到中药多成分协同起效的目的［1］；缓控释制剂作为新型制剂类型，具有用药后能在较长时间内持续释放药物达到延长药效的一类制剂，具有治疗作用持久、降低血药浓度波动、用药次数减少等特点［2-4］。

丹参和三七常用于治疗心脑血管疾病，丹参中丹参酮及丹酚酸类成分和三七中总皂苷均有广泛的药理作用［5-6］。此三类成分性质差异较大，本研究以总丹参酮、总丹酚酸和三七总皂苷3类成分为模型药物，将其分别制成具有不同释药速度的微丸，包括速释、缓释和迟释微丸（肠溶微丸），并对不同释放特性的微丸进行组合，采用相似因子f2法对释放特性进行评价。由于3种微丸具有不同的释放特性，混合后，可实现每日给药一次且达到同步均衡释药的目的。本研究建立的丹参-三七多组分同步均衡给药系统，能够有效调节各成分在体内的血药浓度，增强复方疗效，减少服用次数等特点。

1　仪器与试药

丹酚酸B、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为111562-200605、110852-200806、110745-200421、110703-200424、110754-200421、110704-200420；丹酚酸提取物、丹参酮提取物、三七总皂苷提取物均为广安门医院中药研发药学室制备，批号依次为20120327、20120406、20120514；聚乙二醇4000、羟丙甲基纤维素、泊洛沙姆188购自北京凤礼精求辅料有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30）、聚乙二醇6000、交联聚维酮（PVPP）、微晶纤维素（MCC）购自安徽山河药用辅料有限公司；雅克宜肠溶包衣剂购自上海卡乐康药用辅料有限公司；二甲基硅油购自北京顶业工贸有限公司；尤特奇RSPO购自德国罗姆公司；柠檬酸三乙酯购自阿法埃莎化学有限公司；大豆卵磷脂购自上海仕秀精细化工有限公司；胆固醇购自上海倍卓生物科技有限公司；甲醇和乙腈为色谱纯，购自Fisher公司，其他试剂均为分析纯。

HPLC色谱仪（Agilent 1200，美国Agilent公司），智能溶出试验仪（RC-8DS，天津新天光分析仪器有限公司），电子分析天平（ME 215P型，德国sartorius公司），数控超声波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司），纯水机（Q-Gard型，MILLIPORE公司）。

2　方法

2.1各种释药速度微丸的制备

2.1.1丹酚酸微丸的制备丹酚酸速释微丸的制备［7］：按质量比7∶1∶2分别称取总丹酚酸700 g、交联聚维酮100 g及微晶纤维素200 g，75%乙醇作为黏合剂，采用挤出滚圆法制备丹酚酸速释丸。

丹酚酸迟释微丸的制备［8］：按质量比25∶48∶27称取总丹酚酸250g、HPMC（K4M）480g和PVPK30270 g，用69%乙醇作为黏合剂，采用挤出滚圆法制备丹酚酸迟释微丸。

丹酚酸缓释微丸的制备：采用包衣技术制备缓释微丸，以Eudragit RSPO为缓释膜材，加入0.6 g柠檬酸三乙酯和1.5 g滑石粉，制备包衣液，将丹酚酸迟释微丸于包衣锅内包衣，增重15%，即可。

2.1.2丹参酮微丸的制备丹参酮速释微丸的制备［9］：称取总丹参酮100 g，将质量比为1∶1的PEG4000和PEG6000作为辅料，混匀，称取500 g，药辅比为1∶5；5%药辅量的泊洛沙姆作为增溶剂，70℃水浴加热熔融，搅拌制备丹参酮固体分散体；冷凝剂为黏度为1000 cs的二甲基硅油，温度为20℃，滴距为4 cm，以30～40滴/min的滴速滴制丹参酮速释滴丸。

丹参酮肠溶微丸的制备：取丹参酮速释滴丸200 g，以50 g雅克宜肠溶包衣剂为肠溶膜材，加入0.25 g二甲基硅油作为消泡剂配制包衣液，于包衣锅内包衣，增重12%，即可。

丹参酮缓释微丸的制备：采用包衣技术制备缓释微丸，以48 g Eudragit RSPO为缓释膜材，加入4.8 g柠檬酸三乙酯和15 g滑石粉，用乙醇制备包衣溶液，将丹参酮滴丸于包衣锅内包衣，增重20%，即可。

2.1.3三七总皂苷微丸的制备三七速释微丸的制备［10］：以6∶1的磷脂和胆固醇为辅料，水相（pH6.8的磷酸盐缓冲液）∶有机相（氯仿）为1∶4，药物浓度为20 mg/mL，磷脂为150mg，采用逆向蒸发法制备脂质体；脂质体加入5%甘露醇及蔗糖作为冻干保护剂，冷冻干燥，研细即得三七总皂苷脂质体冻干粉。以75%乙醇为黏合剂，采用挤出滚圆法制备三七皂苷速释丸。

三七肠溶微丸的制备：取三七速释微丸200 g，以60 g雅克宜肠溶包衣剂为肠溶膜材，加入0.3 g二甲基硅油作为消泡剂，于包衣锅内包衣，增重20%。

三七缓释微丸的制备：取三七速释微丸200 g，以18 g Eudragit RSPO为缓释膜材，加入1.8 g柠檬酸三乙酯和4.5 g滑石粉，于包衣锅内包衣，增重4%。

2.2丹参-三七胶囊和同步均衡缓释胶囊的制备

按临床优化处方量，将总丹酚酸、总丹参酮和三七总皂苷混合均匀后装胶囊，即得丹参-三七胶囊，用于对比。将各成分的速释、迟释和缓释微丸以不同比例进行组合，丹酚酸组合比例依次为：1∶2∶3（组合一）、1∶3∶2（组合二）、1∶3∶3（组合三）；丹参酮依次为：1∶1∶1（组合一）、1∶2∶2（组合二）、1∶1∶2（组合三）；三七皂苷依次为：1∶1∶1（组合一），2∶3∶5（组合二），1∶2∶2（组合三）；分别装入胶囊，即得各成分同步均衡缓释胶囊。

2.3释放度测定

依据《中国药典》2015年版［12］释放度测定法第一法，250mL pH值4.5的磷酸盐缓冲液作为释放初始介质，2 h后用氢氧化钠溶液调pH值至6.8，转速为100 r/min，温度为（37.0±0.5）℃。分别于1、2、4、6、8、10、12 h时间点取样2mL，取样后补加等量的释放介质。取样液过滤，按本实验室已验证的HPLC方法测定［8-10］，并计算各物质的释放度。

2.4不同成分释放均衡性分析

采用相似因子（f2）法对3类成分体外释药曲线相似性进行比较，分析7种有效成分（丹酚酸B、隐丹参酮和丹参酮ⅡA、三七皂苷R1和人参皂苷Re、Rg1、Rb1）的释药特性，f2计算公式如下：

其中n为测试点数（n≥3），Rt和Tt为受试样品和对照组分第t时间点的平均累积释放度，Wt为权重因子。f2值的范围在0～100，f2值越大，两条曲线的相似性越高，可用于评价特定溶出条件下溶出曲线的相似性，当f2≥50时，所有时间点的平均释放度差异不大于10%。FDA与EMEA规定：若受试与参比制剂的溶出曲线间的f2值不小于50，则认为两者相似［11-12］。

2.5释放动力学模拟方程

采用零级、一级动力学、Higuchi方程、Ritger-Peppas模型，对3种成分的释放曲线进行拟合，阐明均衡缓释制剂中3类成分的释放特性，拟合方程为：

上述模型中，t为释药时间，Mt为t时药物释放量，M∞为最大药物释放量，Mt/M∞为t时的药物释放分数，k是药物释放速率常数；n为释放参数，表征释放机制的特征参数，该参数与制剂骨架形状有关，当0.45＜n＜0.89时，药物释放机制为非Fick扩散；当n＜0.45时，为Fick扩散；当n＞0.89时，为骨架溶蚀机制［13-14］。

3　结果

3.1各组分不同释药微丸的释放曲线

按照“2.3”项下方法对不同组合胶囊测定释放度，并绘制累积释放度曲线，可看出当速释和肠溶微丸的比例增加时，释放速度加快；通过对不同释放特性微丸的比例进行调整，即可达到不同的释放效结果见图1～3。

图1　丹酚酸微丸不同组合胶囊中丹酚酸B的累积释放曲线

图2　丹参酮微丸不同组合胶囊中丹参酮‖A和隐丹参酮的累积释放曲线

图3　三七皂苷微丸不同组合胶囊中四种皂苷成分的累积释放曲线

3.2释放均衡性分析

按照丹参酮组合三、丹酚酸组合二、三七皂苷组合二将不同组分不同释药速度的微丸装入胶囊，测定释放度并绘制累积释放度曲线，试验结果见表1、图4。

表1　三类成分不同时间点的累积释放率（%）

图4　均衡释放曲线

按“2.4”项下方法计算3类成分间的f2值。其结果为丹参酮和丹酚酸的f2为52.00，丹参酮和三七皂苷的f2为57.13，三七皂苷和丹酚酸的f2为60.96，f2均在50～100间，表明采用此组合所测得丹参酮、丹酚酸和三七皂苷的释放曲线具有较好的相似性，说明该组合能实现3类成分同步均衡缓慢释药的目的。

3.3同步均衡缓释胶囊与普通胶囊的释药速率比较

按“2.3”项下的释放度测定方法，普通胶囊中丹酚酸和三七总皂苷在50min内累积释放量达到80%以上，丹参酮在2 h内基本未释放，普通胶囊不能同步释放，亦不存在缓释特性；而同步均衡缓释胶囊中的3种组分不仅同时释药，且各组分间释药曲线相似性较高，在12 h内达到均衡释放的目的，且释药速率明显减缓，基本实现同步均衡缓慢释放的目的。丹参-三七同步均衡缓释胶囊与自制普通胶囊的释放度结果见图4～5。

图5　丹参-三七普通胶囊释药曲线

3.4丹酚酸-丹参酮-三七总皂苷3类成分的释放动力学拟合结果

分别采用零级、一级动力学、Higuchi方程、Ritger-Peppas模型对丹酚酸、总丹参酮和三七总皂苷的释放动力学进行拟合，结果显示，胶囊中丹酚酸在零级释药方程中拟合相关性较高，丹参酮和三七皂苷较符合Higuchi动力学方程；根据R-P方程拟合结果，丹酚酸n=0.7741，丹参酮n=0.4817，三七皂苷n= 0.6683，0.45＜n＜0.89，显示各成分的释药机制均为药物扩散和骨架溶蚀的协同作用。见表2。

表2　各成分释药曲线拟合方程

4　讨论

本研究利用多元微丸释药系统，先将难溶性成分丹参酮制备为固体分散体，其微丸溶出度大幅增加［9］；再将难以吸收的三七总皂苷制备为脂质体，可有效提高其口服吸收［15-16］；最后将其分别制成具有不同释药速度的速释、迟释和缓释微丸；并将具有不同释药速度的微丸进行组合，可有效调控各成分的释放速度，实现多种组分同步均衡缓慢释放的目的。

目前多种组分的同步释放体外评价方法主要有f2法、kalman滤波法、指纹图谱相似性评价法等［17-19］。其中f2法作为定量描述制剂体外溶出曲线相似性的非模型依赖方法，简单易行、结果可靠，同时该方法为口服固体制剂的处方筛选、生物等效性评价等提供判定依据；缺点是其主要适用于两条释放曲线间相似性的比较，使用范围较局限。而kalman滤波法是通过计算物质组释放/溶出浓度，来评价中药物质组释放/溶出动力学特征，需以物质组的标准谱为基础，进而实现释放度的定量评价，但目前中药标准谱还存在较大空白，缺乏具体定量的评价标准。因此，f2法和指纹图谱法仍是评价中药多组分同步均衡缓释给药较理想的方法。

本研究设计的核心思想是为实现差别巨大的多种成分同步、均衡缓慢释放，实现血药浓度的一致性和平稳性，更好发挥多组分的协同作用。但药物的体外释放行为与其口服吸收、体内处置和药理效应等多种因素影响。因此，如何更好的组合不同释药行为的微丸，科学预测整体释放行为及体内外相关性评价等问题，还需进一步研究。

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Development of synchronized and sustained release system capsule of Salviam iltiorrhiza and Panax notoginseng

ZHANG Qiuyan1LINa1，2CUIHanming1
1.Research Center of Chinese Material Medica，Guang＇anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China；2.Nanjing Institute of Chinese Material Medica，Yangtze River Pharmaceutical Group，Jiangsu Province，Nanjing 210049，China

Objective To develop a synchronized and sustained release system of Salviamiltiorrhiza and Panax notoginseng.M ethods Matrix erosion，solid dispersion system，liposome and membrane controlled-release technology，Salvianolic acid were used.Tanshinone and Panax Notoginseng Saponin were prepared tomicro-pillwith different drug release rate，such as quick-release，delayed-release and sustained-release pills.Then themicro-pills of each component were combined according to its release rate，and the similarity factor（f2）were calculated and the combinations of the similar release curve were selected to combine again.Compared with general capsules，the suitable combination could be achieved a synchronous equilibrium release system for the release within 12 hours for each target ingredient.Results The proportion of quick release，delayed and slow releasemicro-pillwere 1∶3∶2 for Salvianolic acid，1∶1∶2 for Tanshinone and 2∶3∶5 for Notoginseng Saponins，the obtained release f2from Tanshinone compared with Salvianolic acid was 52.00，the f2from Salvianolic acid compared with Panax Notoginseng Saponinswas60.96，the f2from Tanshinone compared with Panax Notoginseng Saponins was 57.13.The drug release curve of each effective component was similar，and the release rate was slow down significantly compared with the ordinary capsule.Conclusion Themicro-pill have different release rate that can achieve the purpose ofmulti-component release synchronously，balanced，and delayed bymultiple unit micro-pill release system，which provide a new method for realizing slow release system.

Salvianolic acid；Tanshinone；Panax Notoginseng Saponins；Synchronous equilibrium drug release system；Slow controlled release

R914.1

A

1673-7210（2016）06（c）-0131-05

国家重大新药创制专项资助项目（2012zx091022 01-006）；广安门医院科研专项所级滚动培育项目（2014S303）。

张秋燕（1983-），女，硕士，主要从事中药分析及药效物质基础研究。

崔翰明（1972-），男，硕士，主要从事中药药效物质、质量分析和新制剂研究。

（2016-01-20本文编辑：赵鲁枫）