鲍氏志贺菌临床分离株的毒力基因检测及分子分型

孙阳，张豪杰，郭文学，王哲，贾宇驰，祁伟

鲍氏志贺菌临床分离株的毒力基因检测及分子分型

孙阳，张豪杰，郭文学，王哲，贾宇驰，祁伟△.

目的了解鲍氏志贺菌临床分离株毒力基因分布、耐药性、分子分型及菌株间流行病学相关性。方法从我院2015年6月—10月间门诊就诊腹泻病患者的粪便中分离收集9株鲍氏志贺菌。采用K-B纸片扩散法行抗生素药敏试验，聚合酶链反应技术检测毒力基因，脉冲场凝胶电泳技术及多位点序列分型确定分子分型，分析菌株间流行病学相关性。结果9株鲍氏志贺菌共分为3个血清亚型:Ⅰ型1株，Ⅱ型3株，Ⅳ型5株。9株菌均为多重耐药菌:对氨苄西林耐药率为9/9，对头孢他啶、链霉素、庆大霉素、复方新诺明、头孢噻肟、头孢曲松、四环素、诺氟沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为1/9、4/9、4/9、4/9、5/9、5/9、6/9、6/9、6/9，未发现阿米卡星、头孢哌酮-舒巴坦和亚胺培南耐药株；ipaH的检出率为100%，sen、set1A、set1B、ial、virA、icsA、sigA的检出率均为0，pic、sepA、sat的检出率分别为4/9、5/9、7/9；9株鲍氏志贺菌通过脉冲场凝胶电泳共分为8种谱型，相似性在63.21%～100%。多位点序列分析结果显示6株为ST648，2株为ST131、1株为ST10。结论本院分离的9株鲍氏志贺菌共分3个血清亚型，多重耐药情况严重，菌株间亲缘关系相对较远，属非暴发病例。

志贺菌属，鲍氏；微生物敏感性试验；电泳，凝胶，脉冲场；毒力基因；脉冲场凝胶电泳；多位点序列分型

志贺菌是引起细菌性痢疾的重要病原菌，主要分为4个血清型:A群痢疾志贺菌除了有内毒素外，还存在外毒素，即志贺毒素，因此引起的病情较重；B群福氏志贺菌感染易转变为慢性；C型主要为鲍氏志贺菌，研究较少；D群宋内志贺菌抗原单一，只有1个血清型，多引起轻型感染［1］。研究认为，D群志贺菌的作用机制可能与细菌内的鸟氨酸脱羧酶有关，鸟氨酸脱羧酶能够促使肠道黏膜细胞的增生和分化［2］。目前，有关鲍氏志贺菌的临床资料较少，而我院夏季肠道门诊感染鲍氏志贺菌的患者均会有腹泻症状，且多为黏液样和水样便。据估计，每年全球大约1.65亿人感染细菌性痢疾，死于该疾病者约110万人［3］。目前，引起感染的优势菌在我国主要为福氏志贺菌，鲍氏志贺菌感染较少［4］。本研究旨在分析鲍氏志贺菌的特点及亲缘关系，应用聚合酶链反应、脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）技术分析其进化轨迹及菌株的相似性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及来源收集2015年6月—10月分离自天津医科大学第二医院肠道门诊就诊患者的粪便标本，共计9株，经常规生化及血清凝集试验均已证实为鲍氏志贺菌。质控菌株大肠杆菌ATCC25922和沙门菌布伦敦卢普（Braenderup）血清型H9815为本研究所保存。

1.1.2 主要仪器与试剂DNA扩增热循环（PCR）仪（德国Eppendorf公司）、DYY-6D型电泳仪（北京六一仪器厂）、GEL-DOC-200型凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）。高压蒸汽灭菌器（山东安得医疗科技有限公司）、DNP-9082BS-Ⅲ型电热恒温培养箱（上海市新苗医疗器械制造有限公司）。志贺菌4种多价混合血清及分群血清购自宁波天润生物药业有限公司。水解酪蛋白（MH）琼脂购自上海伊华生物科技有限公司。13种药敏纸片:氨苄西林（AMP）、头孢他啶（CTZ）、头孢噻肟（CTX）、头孢曲松（CTR）、亚胺培南（IMP）、庆大霉素（GM）、链霉素（STR）、四环素（TE）、左氧氟沙星（LVP）、诺氟沙星（NOR）、阿米卡星（AMK）、复方新诺明（SMZco）及头孢哌酮-舒巴坦购自北京天坛生物制品研究所。琼脂糖（Sea Kem GoldAgarose）购自龙沙（中国）投资有限公司，DNA聚合酶、蛋白酶K、内切酶XbaⅠ、月桂酰基肌氨酸钠购自生工生物工程（上海）股份有限公司，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。基因测序委托南天生物（北京）贸易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 血清分型及生化鉴定菌株血清及生化鉴定按照《细菌性和阿米巴性痢疾诊断标准（WS 287-2008）》附录A进行，生化反应采用API20E生化鉴定卡（法国梅里埃公司）。

1.2.2 抗生素敏感（药敏）试验采用改良KirbyBauer（K-B）纸片扩散法，质控菌株为ATCC25922。根据美国临床实验室标准化研究所CLSI/NC-CLS 2013版标准进行判读［5］。

1.2.3 毒力基因检测实验引物设计及退火温度、循环次数参考文献［6-7］的方法进行。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，GEL-DOC-200型凝胶成像系统下观察结果。测序结果经BLAST程序与GenBank数据库公布的标准菌序列进行比对、分析。

1.2.4 PFGE及MLST分型测定志贺菌adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA及recA这7个管家基因，并将基因序列提交至大肠埃希菌/志贺菌MLST数据库（http://mlst.warwick.ac.uk/ mlst/dbs/Ecoli/），查询等位基因值，确定其ST分型，实验步骤及反应参数参考标准指南［8］，Marker为沙门菌布伦敦卢普（Braen-derup）血清型H9812株，内切酶为XbaⅠ，图谱提交网站（http://www.idwhat.com:8080/pulsenet/banthaccisEntryTable. do）进行分析处理。

Tab.1The sequence of primer表1 引物序列

2 结果

2.1 血清分型及生化鉴定结果9株鲍氏志贺菌分为3个亚型:Ⅰ型1株（C2），Ⅱ型3株（C10、C12、C13），Ⅳ型5株（C4、C8、C14、C15、C16）。

2.2 药敏试验结果9株鲍氏志贺菌均为多重耐药菌。其中，AMP的耐药率为9/9，TE、NOR、LVP的耐药率为6/9，CTX、CTR的耐药率为5/9，STR、GM、SMZco的耐药率均为4/9，CTZ的耐药率1/9，9株鲍氏志贺菌全部对AMK、头孢哌酮-舒巴坦和IMP敏感。

2.3 毒力基因检测结果9株鲍氏志贺菌中，ipaH的检出率为9/9，pic的检出率为4/9（C8、C14、C15、C16），sepA的检出率为5/9（C8、C12、C14、C15、C16），sat的检出率为7/9（C4、C10、C12、C13、C14、C15、C16），sen、set1A、set1B、ial、virA、icsA、sigA的基因检出率均为0。其中3株菌同时携带pic、sat、sepA，1株菌同时携带pic和sepA，1株菌同时携带sat和sepA。

2.4 PFGE和MLST分析结果从PFGE聚类分析图可以发现:9株鲍氏志贺菌共分为8个带型，相似性在63.21%～100%。以相似度＞90%判断为同一克隆群:C10和C13属于同一型，相似率为100%，其余菌株各为一型，见图1。MLST库分析显示，两株（C10和C13）属于ST131:adk（53）、fumC（40）、gyrB（47）、icd（13）、mdh（36）、purA（28）、recA（29）；6株（C4、C8、C12、C14、C15、C16）属于ST648:adk（92）、fumC（4）、gyrB（87）、icd（96）、mdh（70）、purA（58）、recA（2）；1株（C2）为ST10:adk（10）、fumC（11）、gyrB（4）、icd（8）、mdh（8）、purA（8）、recA（2），见表2。

Fig.1Cluster analysis of PFGE图1 PFGE聚类分析

3 讨论

志贺菌是细菌性痢疾的主要致病菌。一般情况下，在发达国家志贺菌引起腹泻的优势菌群通常以宋内为主，我国长期以来以福氏为主。但近年来包括天津地区在内的国内很多地区的优势菌群逐渐被宋内菌取代，这可能是因为随着经济的发展，人们免疫力逐渐提高，也可能是基因突变导致非致病菌向致病菌发生了转变［9］。鲍氏志贺菌的感染主要集中在非洲和亚洲部分地区［10］，有关鲍氏志贺菌的生化特点、耐药特点、遗传学特性尚少见报道。本研究结果显示，9株鲍氏志贺菌血分为3个血清型，其中Ⅳ型的菌株占大部分，与Smith等［10-11］研究结果不同。研究认为，这可能和地域相关，鲍氏志贺菌包含3个演化支，因此也可能和来自不同的进化支有关［12］。

本研究药敏试验结果显示，9株鲍氏菌对喹诺酮类药物、CTR和CTX的敏感率较低，这可能和菌株携带的酶（CTX-M）能够水解CTX有关［13］；9株鲍氏菌对第三代头孢中的CTZ耐药株仅1株，对AMK、头孢哌酮-舒巴坦和IMP均敏感。但根据2013年CLSI/NC-CLS文件规定，志贺菌和沙门菌在体外对氨基糖苷类药物敏感，但临床治疗无效，故临床治疗过程中一般不报告其结果。此外，本研究显示，9株鲍氏志贺菌对世界卫生组织推荐临床应用的LVP和CTR的耐药率较高，在临床经验性治疗中已不适合使用，若腹泻患者症状无好转可调整应用CTZ。

Tab.2The characteristics of nine Shigella boydii isolates表2 9株鲍氏志贺菌属的特点

本所分离的9株鲍氏志贺菌对喹诺酮类和第三代头孢菌素的耐药率高于其他血清型。徐明玉等［14］研究显示，宋内志贺菌对环丙沙星的敏感率为100%，对CTX也较敏感。朱美娟等［15］报道宋内志贺菌对氟喹诺酮类药物较为敏感，福氏志贺菌对头孢类药物相对敏感。张国祥等［16］认为宋内志贺菌对氟喹诺酮类药物的敏感性较高。与国外地区相比，有研究认为鲍氏志贺菌对头孢类及喹诺酮类药物均有较好的敏感性，而El-Gendy等［17］研究则显示鲍氏志贺菌对头孢类药物的耐药性较高。因此，虽然细菌的耐药性不断增强，但是宋内和福氏志贺菌并没有对头孢类和氟喹诺酮类均产生严重的耐药性，结合本研究结果笔者认为，除了CTZ，其他药物并不适合应用于腹泻患者的经验性治疗，考虑这可能和其耐药基因的整合相关，也可能和频繁使用抗生素导致基因gyrA突变及细菌产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）［18］和AmpC酶有关［19］，抑或存在基因缺陷，尚需要对更多鲍氏志贺菌进行基因水平的深入研究。

志贺菌通过M细胞进入肠道上皮细胞并释放相关的毒力因子，引发炎症反应，可引起腹痛、腹泻等临床症状，这些临床症状和志贺菌的毒力基因密切相关。侵袭性质粒相关抗原ipaH和侵袭性相关位点ial基因在志贺菌侵入宿主细胞的过程中起重要作用。ipaH位于细菌染色体和质粒上，是多拷贝克隆，不随细菌的反复传代而消失，可用于志贺菌的分子鉴定。9株鲍氏志贺菌均携带ipaH，与相关研究相近［20-21］；ial位于质粒上，易随质粒的丢失而消失［22］。本研究中，9株菌株的ial的基因检出率为0，低于相关报道［7，23］，因菌株均为近期收集，故质粒丢失的可能性较小，具体原因还需进一步研究验证。virA基因位于毒力大质粒上，编码的virA蛋白是EspG/VirA家族的一个成员，在志贺菌侵入到宿主细胞时诱导局部的微管蛋白的降解，释放微管相关蛋白，通过活化Rac1和RhoA，从而导致皱膜形成，有助于细菌进入到宿主细胞内［24］。ial和virA负责细菌侵入宿主细胞，褔氏和宋内志贺菌ial和virA携带率较高［25-26］。但是，9株鲍氏志贺菌均未检测到上述2个基因，考虑可能在致病过程中，其功能被其他毒力基因所取代，这是C群志贺菌的基因特点还是偶然的现象，还需要更多的样本进行佐证。set1和sen分别编码志贺肠毒力1和志贺肠毒素2，其中set1只存在于福氏志贺菌，sen存在于各型志贺菌中，仍以福氏为主［27］。本所收集的9株鲍氏志贺菌中未检出sen和set1，但有研究在鲍氏志贺菌中检出了志贺肠毒素2［28］。另外，志贺菌的毒力因子还包括丝氨酸蛋白酶自转运蛋白（SPATEs）［29］。SPATEs家族分为两类:一类可以对肠上皮细胞产生毒性作用，包括质粒编码毒素（pet）、sat、sigA，其中sat和pet的氨基酸相似率达52%，可以推测二者在可能具有相同的致病机制；第二类对肠道细胞没有毒性作用，包括pic和sepA，pic编码的蛋白酶能够溶解肠道表面的黏液层，临床上可出现水样腹泻的症状，并且有利于细菌的定植；sepA则参与肠道炎症反应的应答。本研究中，9株鲍氏志贺菌的SPATEs携带率相对较高，这与相关报道较为相似［30］。这是否是鲍氏志贺菌的基因特点还需更多的菌株做进一步验证。

PFGE广泛用于菌株的流行病学研究中，能够准确地反映菌株的克隆关系。本研究中的9株鲍氏志贺菌分为8个带型，其中仅2株的相似性为96.72%，ST分型为ST131，与其他7株菌的亲缘关系较远，相似性为63.21%。其余7株各成一型，相似性在70%以上，除C2外都属于ST648，考虑他们可能来自于同一祖先的不同分支。C2属于ST10，和其他菌株的关系较远，但其药敏特点及毒力基因的携带特点和ST131较为相似。

另外，聚类分析显示两株亲缘关系非常近的C10和C13具有相同的耐药表型、ST分型和毒力基因携带状况，属于ST648的6株菌除C14都对AMP、LVP和CTX显示耐药，将菌株的各个特点集中比较，能够清晰地展示亲缘关系相近的菌株之间的特点，也能够通过相同的基因分型在一定程度上预测菌株的分子特性。从PFGE的图谱分析可以看出这9株菌中除C10和C13外，其他各菌株的亲缘关系较远，菌株间无流行病学相关性，非一次暴发病例，属于普通的散发病例。

虽然本研究样本量较小，暂时无法在统计学方面分析鲍氏志贺菌的分子特点，但是本研究准确地提供了本所分离的鲍氏志贺菌的相关信息，这对其他学者在研究鲍氏志贺菌时具有一定的参考价值。

［1］Liu X，Li NS，Xu D，et al.Analysis of drug resistance and virulence genes of Shigella sonnei in Changsha region［J］.Chinese Journal of Infection Control，2014，13（10）:596-600.［刘兴，李宁沙，徐丹，等.长沙地区宋内志贺菌的耐药性及毒力基因分析［J］.中国感染控制杂志，2014，13（10）:596-600］.

［2］Chi L，Li RL，Chen WW.Overview of the physiological and pathologicalcharacteristicsanddrugresearchofornithine decarboxylase［J］.World Chin J Dig，2006，11（10）:979-984.［迟莉，李茹柳，陈蔚文.鸟氨酸脱羧酶的生理病理特点及其药物研究概况［J］.世界华人消化杂志，2006，11（10）:979-984］.

［3］Ahmed AM，Shimamoto T.Molecular characterization of multidrugresistant Shigella spp.of food origin［J］.Int J Food Microbiol，2015，194（2）:78-82.doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.11.013.

［4］Xu YM，Du Y，Shan B，et al.Monitoring of drug resistance of Shigella in 2005—2014 from CHINET［J］.Chinese Journal of Infection and Chemotherapy，2016，16（3）:275-283.［许云敏，杜艳，单斌，等.2005—2014年CHINET志贺菌耐药性监测［J］.中华感染与化疗杂志，2016，16（3）:275-283］.

［5］Sun CG.M100-S23:performance standards for antimicrobial susceptibility testing；twenty-third informational supplement［J］. Chinese Journal of Laboratory Medicine，2013，33（1）:44-50.

［6］Lluque A，Mosquito S，Gomes C，et al.Virulence factors and mechanisms of antimicrobial resistance in Shigella strains from periurban areas of Lima（Peru）［J］.Int J Med Microbiology，2015，305（4/5）:480-490.doi:10.1016/j.ijmm.2015.04.005.

［7］Ding SJ，Sun YX，Fu DQ，et al.Virulence genes detection and typing of pulsed field gel electrophoresis of Shigella sonnei［J］. Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2013，23（18）: 3518-3520.［丁水军，孙永祥，傅丹青，等.宋内志贺菌毒力基因检测与脉冲场凝胶电泳分型研究［J］.中国卫生检验杂志，2013，23（18）:3518-3520］.

［8］Standard Operating Procedure for PulseNet PFGE of Escherichia coli O157:H7，Escherichia coli non-O157（STEC），Salmonella serotypes，Shigella sonnei and Shigella flexneri［E/OL］.http://www. cdc.gov/pulsenet/PDF/ecoli-shigella-salmonella-pfge-protocol-508c.pdf.

［9］Greenhill C.Infectious disease:Genome sequencing reveals how Shigella sonnei spread around the world［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2012，9（9）:487-496.doi:10.1038/nrgastro.2012.160.

［10］Smith AM，Keddy KH，Sooka A，et al.Analysis of a temporal cluster of Shigella boydii isolates in Mpumalanga，South Africa，November to December 2007［J］.J Infect Dev Ctries，2009，3（1）: 65-70.

［11］Ranjbar R，Mammina C，Pourshafie MR，et al.Characterization of endemic Shigella boydii strains isolated in Iran by serotyping，antimicrobial resistance，plasmid profile，ribotyping and pulsedfield gel electrophoresis［J］.Bmc Research Notes，2008，1（1）:1-6. doi:10.1186/1756-0500-1-74.

［12］Kania DA，Hazen TH，Hossain A，et al.Genome diversity of Shigella boydii［J］.Pathog Dis，2016，74（4）:27-33.doi:10.1093/ femspd/ftw027.

［13］Dong LN，Dang RL，Liu SK，et al.Srvey of drug resitance in135 strins of Shigella in URUMQI［J］.Journal of Preventive Medicine of Chinese People's Liberation Army，2013，31（5）:407-410.［董路宁，党荣理，刘栓奎，等.乌鲁木齐地区135株志贺氏菌耐药性调查［J］.解放军预防医学杂志，2013，31（5）:407-410］.

［14］Xu MY，Sun N，Han Y.Bacterium distribution and Drug sensitivity test of 53 Shigella in Da Lian province［J］.Journal of Diseases Monitor and Control，2013，7（10）:596-597.［徐明玉，孙楠，韩焱.大连市53株志贺菌的菌群分布及药敏试验分析［J］.疾病监测与控制，2013，7（10）:596-597］.

［15］Zhu MJ，Jiao LH，Shao ZT，et al.Surveillance and drug resistance analysis of bacterial dysentery in ShunYi District of BeiJing province from 2006 to 2012［J］.Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2013，23（7）:1800-1802.［朱美娟，焦丽辉，邵占涛，等.2006年～2012年北京市顺义区细菌性痢疾监测与耐药性分析［J］.中国卫生检验杂志，2013，23（7）:1800-1802］.

［16］Zhang GX，Zhang CL，Shen LM，et al.The epidemic characteristics of Bacillary dysentery and drug resistance of Shigella［J］.Chinese Journal of Zoonoses，2011，27（12）:1122-1125.［张国祥，张传领，沈利蒙，等.细菌性痢疾流行特点及志贺菌耐药性研究［J］.中国人兽共患病学报，2011，27（12）:1122-1125］.

［17］El-Gendy AM，Mansour A，Weiner MA，et al.Genetic diversity and antibiotic resistance in Shigella dysenteriae and Shigella boydii strains isolated from children aged＜5 years in Egypt［J］.Epidemiol Infect，2012，140（2）:299-310.doi:10.1017/S0950268811000525.

［18］Zhou MR，Cai CZ，Chen RG，et al.Study of 46 shigella sonnei gene mutationandfluoroquinolonesdrugresistance［J］.Medical Laboratory Science and Clinics，2015，30（3）:1-2.［周美容，蔡长争，陈荣贵，等.46株宋内志贺菌的基因突变与氟喹诺酮类药物耐药性的研究［J］.医学检验与临床，2015，30（3）:1-2］.

［19］Wang MG.The challenge of clinical treatment of increasing drugresistance of shigella［J］.Chinese Journal of Infectious Diseases，2012，30（2）:65-66.［王明贵.志贺菌属耐药性上升对临床治疗带来的挑战［J］.中华传染病杂志，2012，30（2）:65-66］.doi: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2012.02.001.

［20］Qu M，Liu GR，Zhang X，et al.The typing of Bactium distribution and virulence genes analysis of bacterial dysentery in Beijing province from 2004 to 2010［J］.2011，21（8）:1850-1853.［曲梅，刘桂荣，张新，等.北京市2004年—2010年志贺菌菌型分布及毒力基因分析［J］.中国卫生检验杂志，2011，21（8）:1850-1853］.

［21］Yi X，Xia SL，Zhang J，et al.Virulence genes detection and molecular typing of Shigella flexneri isolated from four province in China 2007［J］.Chinese Journal of Zoonoses，2010，26（8）:730-734.［易旭，夏胜利，张锦，等.2007年中国四省福氏志贺菌分离菌株的毒力基因检测和PFGE分析［J］.中国人兽共患病学报，2010，26（8）:730-734］.

［22］Zhang Y，Luo XH，Huang SJ，et al.Serotypes and virulence genes of Shigella in Yuyao of Zhejiang，2009—2014［J］.Disease Surveillance，2015，30（6）:468-470.［张一，罗学辉，黄邵军，等. 2009—2014年浙江省余姚市志贺菌菌型分布及毒力基因分析［J］.疾病监测，2015，30（6）:468-470］.

［23］Casabonne C，González A，Aquili V，et al.Prevalence and virulence factors of Shigella spp.isolated frompatients with diarrhea in Rosario，Argentina［J］.Jpn J Infect Dis，2016 Feb 19.［Epub ahead of print］

［24］Schroeder G，Hilbi H.Molecular Pathogenesis of Shigella spp: Controlling Host Cell Signaling，Invasion and Death by Type III Secretion［J］.Clinical Microbiology Reviews，2008，21（1）:134-156.doi:10.1128/CMR.00032-07.

［25］Thong KL，Hoe SL，Puthucheary SD，et al.Detection of virulence genes in Malaysian Shigella species by multiplex PCR assay［J］. BMC Infect Dis，2005，23（5）:8-17.doi:10.1186/1471-2334-5-8.

［26］Kingombe CI，Cerqueira-Campos ML，Farber JM.Molecular strategies for the detection，identification，and differentiation between enteroinvasive Escherichia coli and Shigella spp［J］.J Food Prot，2005，68（2）:239-245.

［27］da Cruz CB，de Souza MC，Serra PT，et al.Virulence Factors Associated with Pediatric Shigellosis in Brazilian Amazon［J］. Bio Med Res Int，2014，88（1）:167-203.doi:10.1155/2014/ 539697.

［28］MokhtariW，NsaibiaS，MajouriD，etal.Detectionand characterization of Shigella species isolated from food and human stool samples in Nabeul，Tunisia by molecular methods and culture techniques［J］.J Appl Microbiol，2012，113（1）:209-222.doi: 10.1111/j.1365-2672.2012.05324.x.

［29］Boisen N，Ruiz-Perez F，Scheutz F，et al.High prevalence of serine protease autotransporter cytotoxins among strains of enteroaggregative escherichia coli［J］.Am J Trop Med Hyg，2009，80（2）:294-301.

［30］Hosseini Nave H，Mansouri S，Emaneini M，et al.Distribution of genes encoding virulence factors and molecular analysis of Shigella spp.isolated from patients with diarrhea in Kerman，Iran［J］.Microb Pathog，2016，92（3）:68-71.doi:10.1016/j.micpath.2015.11.015.

（2016-05-24收稿2016-07-05修回）

（本文编辑陆荣展）

Detection of virulence gene and molecular typing of Shigella boydii isolated from clinical sources

SUN Yang，ZHANG Haojie，GUO Wenxue，WANG Zhe，JIA Yuchi，QI Wei.△
Infectious Disease Institute，the Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China△

ObjectiveTo understand genetic distribution，drug resistance，molecular typing and the epidemiological relativeness between strains of the Shigella boydii virulence.MethodsNine Shigella boydii strains were isolated form stool samples of patients with diarrhea from the Enteric Disease Clinic of the Second Hospital of Tianjin Medical University in June-October 2015.The strains were identified by biochemical test and serum agglutination test.Antibiotics susceptibility test was carried out using the Kirby-Bauer method.Polymerase chain reaction was used for detecting virulence genes. Pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）and multilocus sequence typing（MLST）technique were used to determine the epidemiological relationship between nine Shigella boydii strains.ResultsThere were three subtypes in nine isolated Shigella boydii samples，including one，three and five isolates inⅠ，Ⅱ，Ⅳsubtypes respectively.All of the 9 isolates were multi-drug resistant.The resistant rate of these strains for ampicillin was 100%（9/9），and then the resistant rates of these strains for ceftazidime，streptomycin，gentamicin，trimethoprim/sulfamethoxazole，cefotaxime，ceftriaxone，norfloxacin and levofloxacin were 1/9，4/9，4/9，4/9，5/9，5/9，6/9，6/9 and 6/9，respectively.All of these strains were sensitive to amikacin，cefperazone-sulbactam and imipenem.The ipaH was carried by all the testing strains，and none of the strains carried the sen，set1A，set1B，ial，virA，icsA and SigA.The detective rates of pic，sepA and sat were 4/9，5/9 and 7/9 strains，respectively.Nine shigella boydii strains were divided into 8 PFGE types.The similarity between the spectrums of PFGE was 63.21%-100%. Multilocus sequence typing showed that six isolates were belonged to ST648，two isolates were ST131 and one isolate was ST10.ConclusionNine isolates of Shigella boydii（divided into three subtyping）isolated from our hospital are multi-drug resistant and they have distant relationships，belonging to the dissemination of case.

Shigella，Boydii；microbial sensitivity tests；electrophoresis，gel，pulsed-field；virulence genes；pulsedfield gel electrophoresis；multilocus sequence typing

R378.2，R516.43

A

10.11958/20160440

天津医科大学第二医院感染性疾病研究所（邮编300211）

孙阳（1991），女，硕士在读，主要从事感染性疾病研究

△通讯作者E-mail:qiweiwyx@yahoo.com