原核移植技术对子代小鼠脑组织mRNA表达谱的影响

李天杰，曹延祥，金小虎，3，4，赵红翠，3，4，于洋，3，4△，乔杰，3，4

实验研究

原核移植技术对子代小鼠脑组织mRNA表达谱的影响

李天杰1，曹延祥2，金小虎1，3，4，赵红翠1，3，4，于洋1，3，4△，乔杰1，3，4

目的探讨原核移植（PNT）技术对子代小鼠脑组织mRNA表达谱的影响。方法将SPF级ICR（CD-1）雌鼠超促排卵并与雄鼠交配受精后，收集雌鼠受精卵进行原核移植，获得重构胚胎，将其移植到假孕小鼠输卵管内获得原核移植子代小鼠（PNT组），未经原核移植操作的受精卵经过胚胎移植后获得子代小鼠（对照组）。提取2组小鼠脑组织RNA，逆转录为cDNA后荧光染料标记，利用Agilent小鼠mRNA芯片检测2组mRNA表达谱差异，筛选差异表达的mRNA并进行GO和信号通路分析。结果PNT组与对照组表达差异倍数在2倍以上的mRNAs有392个，占所有mRNAs的1.7%，其中366个表达升高，26个表达降低；表达差异倍数在4倍以上的共11个。上述差异表达的mRNAs经GO分析结果显示靶基因富集于mRNA可变剪接、小GTP酶介导的信号转导、胰岛素受体信号通路调节等生物学过程以及水解酶活性、跨膜转运蛋白活性、焦磷酸酶活性等分子功能。信号通路富集分析结果显示靶基因集中在离子通道转运、脂肪酸代谢、丁酸甲酯代谢、三酰甘油和酮体代谢等信号通路。结论原核移植可能会对小鼠脑组织一些关键代谢过程产生影响。

核移植技术；胚胎移植；脑；RNA，信使；基因表达谱；计算生物学；原核移植

线粒体是细胞内进行氧化磷酸化生成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所。作为一种半自主性的细胞器，线粒体具有相对独立的复制、转录和翻译系统［1］。线粒体DNA（mtDNA）可以发生突变，当突变达到一定阈值时会导致线粒体疾病的发生。mtDNA突变主要影响能量代谢比较旺盛的器官，包括脑、心脏、肝脏和肌肉等［2］。原核移植（pronuclear transfer，PNT）技术是一种核质置换技术，是指卵母细胞受精形成原核后，将雌雄原核共同取出并移植进入新胞质的过程。PNT在线粒体疾病的治疗中具有潜在的临床应用价值，但该技术对子代的长期影响还不得而知。本文旨在通过构建PNT小鼠模型，研究PNT对子代小鼠脑组织mRNA表达谱的影响，为进一步评估该技术的风险和长期应用的安全性提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级ICR（CD-1）小鼠，雌性35只，雄性20只，8～10周龄，体质量27～33 g，购自北京大学医学部动物中心。饲养环境为30%～60%湿度，21～24℃，光照时间为每天5:00—19:00，无限制获取食物和水。本实验通过北京大学医学部动物伦理委员会批准，所有操作严格遵守相关法律法规。

1.2 主要试剂和仪器卵子处理液G-MOPS和HSA购自美国Vitrolife公司。KSOM小鼠胚胎培养液购自德国Merck Millipore公司。孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）购自宁波第二激素厂。人绒毛膜促性腺激素（hCG）购自丽珠集团丽珠制药厂，使用前用生理盐水稀释至所需浓度。TRIzol购自美国Invitrogen公司。Nucleospin®ExtractⅡ试剂盒购自德国MN公司。细胞松弛素B购自美国Sigma公司。显微操作系统购自日本Narishige公司。倒置和体式镜购自日本尼康公司。电融合仪购自美国BTX公司。

1.3 雌鼠受精卵收集雌性CD-1小鼠腹腔注射10 IU PMSG，48 h后注射10 IU hCG诱导超排。将超排雌鼠与雄鼠按照1∶1合笼，次日上午检查阴道栓，有阴道栓者认为交配成功［默认雄鼠在黑暗期的中点前后（约24:00）与超排雌鼠交配］。交配后第2天中午前收集受精卵。采用断椎法处死小鼠，打开腹腔，截取输卵管壶腹部，放入G-MOPS液中。在体视显微镜下，用1 mL注射器的针尖划破壶腹部，释放出含有卵丘细胞-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes，COCs）的白色卵团。将卵团移入0.2%透明质酸酶中，反复吹打去除颗粒细胞。在倒置显微镜下观察卵母细胞受精情况，排出第二极体或形成双原核（2PN）的卵母细胞认为受精成功。将受精卵移入预先平衡好的KSOM培养液中，放置于培养箱中37℃，5%CO2，95%湿度孵育。

1.4 PNT将受精卵在含有5 mg/L细胞松弛素B的操作液中孵育5 min。用持卵针将受精卵固定于适当位置，使用去核针在piezo压电脉冲的辅助下，去除部分透明带，去核针经透明带切口小心吸出受精卵内雌原核和雄原核，注意尽量少带原核周围的胞浆。将雌雄原核注入另外已经去掉双原核合子的卵周隙后，将其移入KSOM培养液中继续孵育1 h。之后将重构胚胎移入电融合仪电极间的融合液中，注意使待融合的两质膜平面与电场方向垂直，融合时采用直流电压1 000 V/cm作用10 μs，给予2次脉冲。融合结束后将重构胚胎用KSOM培养液清洗3遍，继续培养1 h并观察融合情况。成功融合的重构胚胎移入新的培养液中培养。

1.5 胚胎移植取动情期雌鼠，与输精管结扎的雄鼠进行交配，次日上午检查阴道栓，有阴道栓者被认为假孕成功。将体外培养至2-细胞期的重构胚胎移植入假孕0.5 d雌鼠的输卵管内，孕19.5 d自然生产可得到PNT仔鼠，记为PNT组。未经PNT操作的受精卵，体外培养到2-细胞期，作为对照组进行胚胎移植，所得仔鼠记为对照组。分别记录2组胚胎移植和产仔情况。

1.6 样本处理及杂交生长至成年的2组小鼠每组各取3只雌鼠，采用断椎法处死，小心取下脑组织，-80℃冰箱冻存。Trizol法提取脑组织中的总RNA，纯化后采用分光光度计对总RNA进行定量（A260/280），1.3%甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量。将RNA逆转录成cDNA后，用Cy3-dCTP（绿色）荧光染料标记PNT组和对照组cDNA，并对标记后的cDNA进行纯化，紫外分光光度计对纯化后的荧光标记产物进行荧光掺入量和核酸定量。每个样本取110 pmol标记产物与芯片上机于45℃杂交过夜。芯片采用Agilent公司的小鼠mRNA芯片V1.0，芯片格式为4×180K，可检测39 027个小鼠mRNA。这些mRNA靶序列可以与众多数据库包括NCBI、RefSeq、Ensembl、UCSC等互相兼容。

1.7 图像采集和数据分析使用Agilent Feature Extraction（v10.7）软件对杂交图片进行分析并提取数据。然后使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析，计算表达差异和统计学P值。应用Cluster 3.0软件进行聚类分析。使用基于京都基因与基因组百科全书的直系同源注释系统（KEGG Orthology Based Annotation System，KOBAS）软件同时进行通路和功能分析，包括7个通路数据库（KEGG PATHWAY、PID Curated、PID BioCarta、PID Reactome、BioCyc、Reactome和Panther）和1个功能数据库（Gene Ontology）。统计学处理采用SPSS 20.0软件包完成，计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胚胎移植和产仔情况将发育至2-细胞阶段的2组胚胎移植到假孕母鼠体内，共移植3次，每次各移植12枚。结果显示，PNT组产仔率低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而2组子代存活率差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 RNA质量分析样品总RNA A260/280在2.03～2.17之间，RNA浓度在0.457～1.359 μg/μL之间，RNA基本完好，未发现降解。甲醛变性胶电泳显示样品18 S和28 S呈现两条清晰条带，质量符合表达谱芯片的实验要求，见图1。

Tab.1The embryo transfer and number of pups in two groups表1 2组胚胎移植和产仔情况

Fig.1RNA integrity test by denaturing agarose gel electrophoresis图1 样品总RNA电泳图

2.3 芯片杂交结果2组芯片杂交共检测出23 336个mRNAs，其中以2组比较有2倍以上变化且差异有统计学意义的mRNA确定为差异表达的mRNAs。本实验中差异表达的mRNAs有392个，占所有mRNAs的1.7%。其中有366个表达升高，26个表达降低，见图2。差异表达倍数在4倍以上的mRNAs共11个，见表2。聚类分析显示PNT组和对照组基因表达具有显著差异，见图3。

Tab.2The differentially expressed mRNAs that fold change＞4.0表2 4倍以上差异性表达的mRNAs

2.4 GO（Gene Ontology，基因本体）分析和信号通路分析对上述差异表达基因进一步行GO和信号通路分析。GO包括基因的生物学过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular functions，MF）。GO功能注释显示，在BP中显著富集到的GO功能包括mRNA可变剪接、小分子鸟苷三磷酸酶（小GTP酶）介导的信号转导、胰岛素受体信号通路调节等；MF包括水解酶活性、跨膜转运蛋白活性、焦磷酸酶活性等，见图4。差异基因的信号通路富集分析结果表明，显著富集的通路包括离子通道转运、Bcl-xl/Bcl-2相关死亡促进因子（BAD）激活并向线粒体迁移、脂肪酸代谢、丁酸甲酯代谢、三酰甘油和酮体代谢等，见图5，这些通路都与代谢密切相关。

3 讨论

线粒体是细胞的能量供给中心，其突变可以导致多种细胞、组织和器官的功能障碍，且目前尚无较好的治疗手段。mtDNA遵循母系遗传，即受精卵中几乎所有的mtDNA均来源于卵细胞［3-4］。既往患有线粒体疾病的女性患者生育只能依赖于胚胎植入前遗传学诊断（PGD）和产前诊断技术获得携带突变基因但是不发病的患儿，但是这两种干预方式都比较被动［5-7］。核质置换技术的出现为线粒体疾病的治疗提供了新的思路。目前的核质置换技术包括极体移植（polar body transfer，PBT）、生发泡移植（germinal vesicle transfer，GVT）、纺锤体移植（spindle transfer，ST）以及PNT［6-7］。目前人群中尚无PBT应用。GVT涉及的卵母细胞体外成熟可能会影响卵母细胞发育潜能。ST虽然在非人灵长类动物身上取得了成功［8］，但是由于纺锤体对机械刺激比较敏感，并且缺乏核膜包绕，可能会影响纺锤体排列。因此，PNT更能体现潜在的临床应用价值。

大脑是中枢神经系统最重要的组成部分，也是能量代谢最为旺盛的器官之一。本研究利用mRNA表达谱芯片分析PNT小鼠脑组织mRNA表达谱的变化，从而评估PNT对小鼠脑组织关键基因表达谱的影响。392个差异表达基因结果提示，PNT对子代脑组织的基因表达会造成一定的影响，并且这些基因中，一些已经被证明与疾病相关。如Klhl2（kelch-like 2）与神经退行性疾病相关［9］，Pdyn（prodynorphin）突变可以引起脊髓小脑共济失调23型［10］，并且与阿尔茨海默病和年龄相关的认知缺陷存在一定相关性［11］。

GO分析结果显示，这些差异表达的mRNAs与一些细胞内物质和能量代谢过程相关，包括小GTP酶介导的信号转导、胰岛素受体信号通路等。小GTP酶是广泛存在于真核生物中的单体GTP结合蛋白，在神经发育［12］、血细胞功能［13］、癌症发生［14］以及细胞自噬［15］等方面都有非常密切的调控作用。胰岛素受体信号调节通路与2型糖尿病的发生发展密切相关［16］。信号通路分析结果表明，这些差异mRNAs与离子通道转运、BAD激活并向线粒体迁移、脂肪酸代谢、丁酸甲酯代谢、三酰甘油和酮体代谢等过程密切相关，提示PNT对代谢过程可能会造成一定影响。细胞离子通道的结构和功能是维持正常生命活动的基础，离子通道功能障碍与神经退化性疾病在内的许多疾病密切相关［17-20］。酮体代谢对于许多退行性神经疾病具有神经保护作用［21-22］。

PNT应用过程中的关键问题之一是其应用的安全性。其操作过程包括供体细胞雌雄原核的共同取出，以及雌雄原核共同移植进入去核受体细胞胞质，因此，供体和受体的线粒体均有存留的可能。另外，有研究表明，组织相容性复合物可能会经过线粒体进行转移［23］，这些都可能对PNT技术在临床中的应用提出挑战。因此，随着研究的不断深入，期望在不久的将来，能将PNT技术真正用于临床。

（图2～5见插页）

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（2016-07-27收稿2016-08-15修回）

（本文编辑胡小宁）

Study on expression profile of mRNA in brain of pronuclear transfer mice

LI Tianjie1，CAO Yanxiang2，JIN Xiaohu1，3，4，ZHAO Hongcui1，3，4，YU Yang1，3，4△，QIAO Jie1，3，4
1 Center of Reproductive Medicine，Department of Obstetrics and Gynecology，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China；2 Chinese PLA Medical School；3 Key Laboratory of Assisted Reproduction，Ministry of Education；4 Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology△

ObjectiveTo investigate the expression profile of mRNAs in brain samples collected from pronuclear transfer（PNT）mice.MethodsFemale CD-1 mice were superovulated，and zygotes were collected after mating with adult male mice.Zygotes with two pronuclei were selected for pronuclear transfer manipulation，and then the reconstructed zygotes were transferred into the oviduct of pseudopregnant female mice.The infant mice obtained from pronuclear transfer were called PNT group，while the embryoes that were not performed pronuclear transfer was regarded as control group.Total RNA were extracted from brain samples of both PNT and control mice，and cDNA were labeled with fluorescent dye.Genes that were differentially expressed were identified using the Agilent mouse mRNA array.Gene ontology analysis and pathway analysis were also completed.ResultsCompared with control group，392 mRNAs were expressed differentially，which showed more than 2.0 times variation and statistical significance，accounting for 1.7%of all mRNAs.Among those 366 mRNAs were up-regulated and 26 mRNAs were down-regulated.Eleven mRNAs came to 4.0 times variation in total.Gene ontology analysis indicated that differentially expressed genes were significantly enriched in alternative mRNA splicing，small GTPase mediated signal transduction，regulation of insulin receptor signaling pathway，hydrolase activity，transmembrane transporter activity and pyrophosphatase activity.Significant enriched pathway terms contained ion channel transport，fatty acid metabolism，butanoate metabolism，triacylglycerol and ketone body metabolism.Conclusion Pronuclear transfer might influence some key metabolism process in mouse brain.

nuclear transfer techniques；embryo transfer；brain；RNA，messenger；gene expression profiling；computational biology；pronuclear transfer

R394.3

A

10.11958/20160746

国家自然科学基金资助项目（31371521）；生殖内分泌与辅助生殖技术北京市重点实验室2015年度科技创新基地培育与发展专项项目（Z151100001615023）

1北京大学第三医院妇产科生殖医学中心（邮编100191）；2解放军医学院；3教育部辅助生殖重点实验室；4北京市生殖内分泌与辅助生殖重点实验室

李天杰（1992），女，硕士在读，主要从事生殖内分泌与辅助生殖技术的研究

△通讯作者E-mail:yuyang5012@hotmail.com