GABAARG2基因C588T多态性与癫痫的相关性研究

梁　维，许志恩，方洪明



GABAARG2基因C588T多态性与癫痫的相关性研究

梁维1，许志恩1，方洪明2

目的探讨中国粤西地区汉族人群GABAARG2基因C588T的单核苷酸多态性与癫痫的关系。方法采用病例-对照研究方法，收集粤西地区汉族人群189例癫痫患者，100例健康人作为正常对照组，根据患者对抗癫痫药物的反应性分为耐药组(92例)和药物敏感组(97例)，提取所有研究对象外周血基因组DNA，采用PCR扩增后基因测序鉴定GABAARG2基因C588T多态性，测定该位点基因型频率和等位基因频率，并进行统计学分析。结果耐药组与药物敏感组、正常对照组的CC、CT、TT基因型频率及C、T等位基因频率比较差异均无统计学意义；药物敏感组与正常对照组的CC、CT、TT基因型频率比较(χ2=6.468，P=0.039)差异有统计学意义，CC与CT优势比为1.669(95%CI=0.842～3.306，P= 0.141)，CC与TT的优势比为2.652(95%CI=1.240～5.668，P=0.011);C、T等位基因频率比较(χ2=7.411，P=0.006)差异有统计学意义，C等位基因与T等位基因优势比为1.737(95%CI=1.166～2.588，P=0.006)。结论GABAARG2基因5号外显子的C588T多态性与癫痫的易感性相关，但与癫痫的耐药风险不相关。

GABAARG2基因；C588T；单核苷酸基因多态性；癫痫

癫痫是由不同原因引起的大脑神经元异常放电中枢神经功能失调综合征。约1/3的癫痫患者在使用抗癫痫药物(AEDs)治疗后仍反复发作、难以控制，成为耐药性癫痫[1]。耐药机制近年来成为癫痫研究的重点和热点。GABAARG2是γ2的编码基因，定位于5q31.1～33.1区域，共85.7 kb，由9个外显子及其间的8个内含子组成。研究证实GABAARG2基因的变异或者表达量的减少参与了热性惊厥(FS)、全面性癫痫伴热性惊厥叠加综合征(GEFS+)等疾病的形成，GABAARG2基因C588T很可能是FS的易感因素[2～4]。孟海娇等[5]发现C588T为国内GEFS+的患者的易感基因，C等位基因在GEFS+组中显著高于其他类型癫痫。Goodkin发现癫痫持续状态下海马锥体细胞的GABAARβ2、β3、γ2表达减少，导致GABAAR对苯二氮卓类药物敏感性下降，甚至失效，说明GABAARG2的基因变异与耐药性癫痫可能存在联系[6]。癫痫受到遗传、种族和地域环境影响，国内目前关于GABAARG2基因多态性与癫痫关系的研究报道甚少，故在中国粤西地区汉族人群首次对GABAARG2基因第5外显子上的C588T多态性与癫痫的相关性进行研究，为研发新型的抗癫痫药提供依据。

1　材料与方法

1.1研究对象收集在我院就诊的诊断明确且用药合理的癫痫患者189例，患者均行24 h动态脑电图，头部CT或MRI。临床有两次时间相隔24 h以上的痫性发作。入选标准：(1)粤西汉族人;(2)临床上有两次时间相隔24 h以上痫性发作;(3)根据发作类型，正确合理用药的癫痫患者。排除标准：(1)临床诊断错误，分型不确切；(2)用药不当或用药不足的癫痫患者；(3)依从性差的癫痫患者；(4)因脑卒中、颅脑外伤、颅内占位性病变等有明确病因的症状性癫痫；(5)肝肾功能不全者。正常对照组为无癫痫病史的健康体检者100例。根据2010年国际抗癫痫联盟给出的耐药性癫痫的定义[7]，我们将癫痫患者分为耐药组和药物敏感组，耐药组92例，药物敏感性组97例。所有研究对象均经知情同意，本研究获广东医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2研究方法

1.2.1提取DNA早晨空腹取肘部静脉血5 ml，至含有EDTA-K2的抗凝试管，用血液基因组DNA快速提取试剂盒提取外周血白细胞的基因组DNA，在-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2PCR扩增GABAARG2外显子5 C588T位点引物设计:上游引物5’-TGTGTTTTCAATCAGAATGTGAG-3’；下游引物5’-GGCAATCAGAAAGACTGTAGG-3’，引物由上海生工生物技术有限公司合成。取50 μl PCR反应管，PCR反应条件：94 ℃预变性2 min(94 ℃变性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s) 34个循环后再于72 ℃延伸8 min，终止反应。所有经过琼脂糖凝胶电泳检测后的PCR产物均送上海生工生物技术有限公司进行基因测序。

1.3统计学分析采用SPSS 19．0软件完成统计处理，首先应用χ2检验分析耐药组和药物敏感组、正常对照组的基因型频率和等位基因频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，如P>0.05，则样本符合Hardy-Weinberg遗传平衡，有群体代表性。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组研究对象一般资料及临床资料比较耐药组92例，其中男性45例，女性47例，年龄10～52岁；药物敏感组97例，其中男性47例，女性50例，年龄8～55岁；正常对照组100例，其中男性52例，女性48例，年龄16～45岁；研究对象的年龄、性别构成在各组间差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)，具有可比性。而耐药组与药物敏感组患者的起病年龄、总病程、治疗前发作次数、既往FS史、癫痫持续状态、24 h脑电图中度以上异常差异有统计学意义(见表2)。

2.2PCR产物电泳结果GABAARG2基因5号外显子的C588T位点PCR扩增产物为单一条带，产物大小符合预先设计，片段长度为268 bp，其基因测序图如下(见图1)。

2.3GABAARG2外显子5 C588T基因型及等位基因频率的分布经χ2检验，在耐药组、药物敏感组和正常对照组中，GABAARG2外显子5的C588T多态位点基因型、等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。耐药组与药物敏感组CC、CT、TT基因型比较(χ2=1.292,P=0.524)及等位基因C、T频率比较(χ2=1.429,P=0.232)差异无统计学意义。耐药组与正常对照组的基因型比较(χ2=2.027,P=0.363)及等位基因频率比较(χ2=2.214,P=0.137)差异亦无统计学意义。而药物敏感组和正常对照组的CC、CT、TT基因型比较(χ2=6.468,P=0.039),等位基因C、T频率比较(χ2=7.411,P=0.006)差异均有统计学意义，在药物敏感组中与CT相比，CC引起的癫痫风险度为1.669。与TT相比，CC引起癫痫的风险度为2.652，与T等位基因相对比，C等位基因的癫痫患病风险度为1.737(见表3)。

表1　耐药组、药物敏感组与正常对照组一般资料对比

表2　耐药组与药物敏感组患者临床资料的比较

表3　药物敏感组与正常对照组C588T的基因型及等位基因频率

图1A.CC纯合子基因型;B.CT杂合子基因型;C.TT纯合子基因型

3　讨　论

目前癫痫耐药机制的药物作用靶点假说，认为抗癫痫药物作用靶点分子结构改变是导致患者对抗癫痫药物的敏感性降低的原因[8]，GABAAR是抗癫痫药物一个重要的作用靶点，是5个亚基组成的多肽大分子配体门控离子通道受体，由苯二氮卓类药物识别点、GABA识别点和氯离子门控通道组成，其亚基包括：α1～6、β1～4、γ1～3、δ、ε、θ、π、ρ1～3[9]。戚月凤[10]在颞叶癫痫模型中发现癫痫发作后GABAARγ2表达减少，并可能导致癫痫进一步发展，随着时间推移，GABAARγ2表达逐渐增多，加强抑制作用，利于防止癫痫反复发作，推测此可能是颞叶癫痫的内源性保护机制。研究显示，GABAAR亚基的表达在抗癫痫药物敏感的大鼠与耐药组的大鼠中比较有明显的差异，这提示GABAAR亚基的变化可能与耐药性癫痫有关[11]。

研究表明热性惊厥(FS)可能更容易导致耐药性癫痫[12，13]，FS和癫痫存在着一定的共同遗传基础[14]。Kananura等[15]首先探索了GABAARG2 基因5号外显子上的C588T(NCBI对应编号：rs211037)与热性惊厥(FS)的相关性，但并未发现C588T为德国人群FS的易感因素，Chou等[2]对台湾人群中104名FS患者及83名正常人研究，发现CC基因型的个体数明显多于对照组，C等位基因高于正常人，等位基因C与等位基因T的优势比为2.56，表明C588T是台湾人群FS的易感因素。而Nakayama[16]在日本的94例FS患者中未发现C588T与FS存在关联。Salam等[3]发现C588T是埃及人群中FS的易感因素，他们选取了100名FS患者与120名健康人作为研究对象，结果和Chou[2]的研究结论一致，与T等位基因对比，C等位基因患FS的风险为2.15，以上的不同结果说明了C588T多态性具有明显的地域性，和种族遗传有关。

尽管C588T在不同种族中有着不同的等位基因频率，但在2010年，Kumari[17]在北印度人群中检测了C588T与癫痫耐药的相关性，但未发现C588T是北印度人群的耐药性的高危因素。2013年Balan[18]在实验中发现C588T与南印度人群癫痫的易感性相关，而未检测出C588T与耐药性癫痫有关联。这更说明单SNP的功能相对有限，在药物敏感性癫痫中可能发挥一定作用。但耐药性癫痫中，单SNP的影响则相对显得微弱，可能是多个SNP的微效果联合叠加，甚至要在特定的环境、特定的诱因的情况下才表现出对药物的耐受甚至抵抗。

本研究对中国粤西汉族人群GABAARG2基因5号外显子的C588T多态性进行分析，发现耐药组与药物敏感组、正常对照组C588T基因型、等位基因频率比较差异均无统计学意义，但在药物敏感组与正常对照组C588T的基因型分布、等位基因频率明显有差异，在药物敏感组中CC、CT、TT基因型分别占36.1%、42.3%、21.6%；正常对照组中分别占22.0%、43.0%、35.0%，在药物敏感组中与CT杂合子相比，CC纯合子引起的癫痫风险度为1.669，与TT纯合子相比，CC纯合子引起癫痫的风险度为2.652，药物敏感组等位基因C、T频率分别为57.2%、42.8%，正常对照组患者分别为43.5%、56.5%，在药物敏感组中与T等位基因相对比，C等位基因的癫痫患病风险度为1.737，CC基因型、C等位基因频率在药物敏感组中显著高于正常对照组，提示GABAARG2基因5号外显子的C588T多态性与癫痫的易感性相关，但与癫痫的耐药风险不相关，研究结果与Kumari[17]、Balan[18]的实验结果是相一致的。

GABAARG2基因第5外显子上的C588T是一个同义突变，虽然不改变γ2的性状，但可以影响蛋白的表达和功能，主要通过以下的机制：(1)同义突变改变了mRNA的碱基组成，导致mRNA的二级结构发生变化，从而影响mRNA结构的稳定性，如G/C含量增加时，mRNA的结构稳定性增强;(2)同义突变有可能产生新的隐藏剪接位点或者影响调控元件，如沉默子、外显子剪接增强子等，从而导致mRNA剪接的异常;(3)同义突变可以影响翻译速率。孟海娇[5]曾用MFOLD预测了C588T的mRNA的二级结构，结果显示C588T在不同的等位基因中,野生型与变突变型的mRNA的二级结构有很大的差异。Balan[18]的实验中也表明C588T在转录调控与剪接调控中起着重要的作用。综上所述，C588T的变异很可能在一定程度上影响了γ2亚基的功能或者使γ2亚基表达水平降低，鉴于γ2亚基对其他亚基具有组装作用，导致GABAAR的整体功能受到抑制，导致中枢系统兴奋-抑制的失衡，从而更容易出现癫痫发作。

目前多数研究认为耐药性癫痫可能是多种因素叠加造成的，耐药性癫痫患者有着起病年龄早，病程较长，发作频率高，症状性癫痫或者隐源性癫痫、脑电图异常程度高，FS病史、癫痫持续状态病史、精神病和癫痫家族史等特征[12,13,19]，从实验中耐药组与药物敏感组的临床资料对比，可以看出，粤西地区的耐药性癫痫患者中6岁以前发病率、病程、发作频率、既往FS史比例、癫痫持续状态史比例明显较药物敏感组高，同时中度以上异常脑电图的概率增高，差异有统计学意义。有研究证明高热、持续状态以及反复发作容易导致耐药性癫痫[6,19～21]。此外，社会的歧视和焦虑抑郁、不规律服药的癫痫患者更容易出现耐药性[22,23]。

耐药性癫痫与药物敏感癫痫的判定标准、入选标准、样本量大小对实验结果有一定的影响，本实验排除了目前影像学上具备明显病灶的症状性癫痫，更注重与遗传相关的非症状性癫痫。但由于目前影像学技术及患者的经济承受能力，尚不能排除潜在诱因的隐源性癫痫，这对实验结果也造成了一定的影响。

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Association study between the C588T polymorphism of GABAARG2 gene and epilepsy

LIANGWei,XUZhien,FANGHongming.

(AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

ObjectiveTo investigate the association between the C588T polymorphism of GABAARG2 gene and drug-resistant epilepsy in Chinese Han population of the Western Guangdong province.Methods189 patients with epilepsy were classified into drug-resistant group (n=92) and drug-responsive group (n=97),according to their responses of antiepileptic drug treatment,and 100 healthy controls were chosen as normal control group.DNA samples were obtained from all these people,the C588T polymorphism of GABAARG2 gene was determined by polymerase chain reaction(PCR) and Gene sequencing.The genotype and allele frequency of the C588T among the three groups was analyzed by Chi-square test.ResultsNo significant differences of genotype frequencies and allele frequencies were identified between the drug-resistant group and drug sensitive group,while no significant differences of genotype frequencies and allele frequencies were identified between the drug-resistant group and normal control group.Significant differences of genotype frequencies were identified between the drug sensitive group and normal control group (χ2=6.468,P=0.039).CC vs CT OR=1.669 (95%CI=0.842～3.306,P=0.141),CC vs TT OR=2.652 (95%CI=1.240～5.668,P=0.011),Significant differences of allele frequencies were identified between the drug sensitive group and normal control group (χ2=7.411,P=0.006),C vs T OR=1.737 (95%CI=1.166～2.588,P=0.006).ConclusionThe C588T polymorphism of GABAARG2 gene is associated with epilepsy susceptibility,but not with antiepileptic drug resistance in Chinese Han population.

GABAARG2 gene；C588T;Single Nucleotide polymorphism；Epilepsy

1003-2754(2016)02-0139-04

2015-12-08；

2016-01-30

(1.广东医学院附属医院，广东 湛江 524001；2.广东省普宁市人民医院，广东 普宁 515300)

许志恩，E-mail:zjxuzhien@126.com

R742.1

A