三种针法对PCPA失眠大鼠神经行为学影响的对照研究

罗本华张亚飞王 燕高炜燕彭敏家

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一临床医学院，广西 南宁530001）

三种针法对PCPA失眠大鼠神经行为学影响的对照研究

罗本华1张亚飞1王 燕1高炜燕2彭敏家2

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一临床医学院，广西 南宁530001）

目的：探讨PCPΑ失眠大鼠认知功能的改变，失眠穴方针刺、脐内环穴针刺及二者合方针刺对PCPΑ失眠大鼠认知功能的影响，并进行针法优选。方法：50只经过造模、筛选的PCPΑ失眠大鼠，随机分模型组、脐内环针刺组、失眠穴方针刺组、脐内环合失眠穴方针刺组和安定对照组各10只，另外10只正常大鼠为正常组。脐内环针刺组采用针刺脐内环穴五脏点；失眠穴方组采用针刺双侧神门、支沟、足三里、三阴交穴；脐内环合失眠穴方组针刺以上两组穴位；安定对照组采用安定灌胃处理；模型组和正常组均不予特殊处理。应用Morris水迷宫评价组大鼠认知功能的变化。结果：（1）PCPΑ失眠大鼠存在学习、再学习和记忆保留能力的全面认知功能损害；（2）在隐蔽平台，三种针法均显示改善学习的能力，但脐内环合失眠穴方针刺组出现疗效最早、稳定和持久，具有疗效优势；（3）在反向试验、探索试验上，三种针法中，只有脐内环合失眠穴方针法改善PCPΑ失眠大鼠再学习能力和记忆保留能力具有统计学意义；（4）可视平台中，六组在平均潜伏期、平均速度上均无差异。结论：PCPΑ失眠大鼠存在全面的认知功能障碍，脐内环穴针刺和失眠穴方针刺均有一定程度的改善PCPΑ失眠大鼠认知功能障碍，作用与安定药物相当；而脐内环合失眠穴方针法起全面改善PCPΑ失眠大鼠认知功能障碍作用，明显优于安定药物，是实验优选方法。

PCPΑ失眠大鼠；认知功能；脐内环穴；失眠穴方针刺；安定

失眠是以入睡及睡眠维持困难为特征的一种最常见的睡眠障碍，是睡眠质量或数量达不到正常需求的一种主观体验；明显影响患者白天活动。随近年社会变革加速，生活工作节奏加快，失眠症发生更加频繁。睡眠作为人生命的重要组成部分，对人体保持充沛的精力体力，维持神经、内分泌、免疫等系统功能正常均有重要意义，因而，失眠是严重影响人们生活质量或危害生命的疾病。失眠症西医治疗大多在于改善症状，改善病因效果差，且副作用大；临床上呈现回归寻求中医、针灸和民族医学等安全可靠疗法的热潮；脐内环针刺、失眠穴方针刺和二者结合的针刺方法就是这类整理、新创的壮医针法、中医针法、中医壮医结合针法，有较深的中医壮医理论根基，是失眠症临床有效验和疗效的方法。本实验研究了该三种针法对 PCPΑ失眠大鼠神经行为学的影响，并同安定药物干预对照，旨在为失眠症临床提供基础依据并进行治疗方法优选，现将实验报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

健康成年Wistar雄性大鼠120只，体重250±15g，由广西医科大学动物实验中心提供；室温20～25℃饲养，室内采光按照白昼循环模式，定时喂食，自由饮水，预养15天。

1.2 动物分组

将所有120只实验大鼠随机分为6组；随机抽取15只为正常组，其余105只大鼠在注射PCPΑ造模后，通过观察昼夜节律等变化，筛选得模型大鼠85例，再按随机数字表法，随机分为模型组、脐内环针刺组、失眠穴方针刺组、脐内环合失眠穴方组、安定对照组5组，每组17只。

1.3 动物造模方法

PCPΑ失眠大鼠模型：对氯苯丙氨酸（PCPΑ，公司：Αlfa，批号：Α13323），临用前按大鼠45mg/lml/100g用量，用弱碱性生理盐水（PH7～8）配置成混悬液备用。

于每日上午 8:00～8:15，每只大鼠腹腔注射 PCPΑ 混悬液 lml/100g，每日一次，连续注射 2日，于第一次腹腔注射PCPΑ28～30h后，动物出现昼夜节律消失，白天也活动不停，整体观察与正常组有明显不同，表明模型复制成功。

正常组：腹腔注射同体积的弱碱性生理盐水，连续注射2日。

1.4 处理方法

于 PCPΑ失眠造模成功并筛选分组后，次日开始实验干预治疗。

（1）正常组 15只：不予任何治疗，只给予同脐内环针刺组相同时间（3分钟）及相同强度的抓摸刺激。

（2）模型组 17只：不予任何治疗，只给予同脐内环针刺组相同时间（3分钟）及相同强度的抓摸刺激。

（3）脐内环针组 17只：给予壮医脐环内穴针刺治疗。刺入脐内环穴点后不行手法，每穴点留针30秒后出针，每次共3分钟。

取穴：参壮医脐内环穴［1］，取大鼠神阙穴［2］：在大鼠脐中央。在脐环周旁开2.5mm处一圈（据上书神阙至中脘约20mm拆算），以正上方为心，正下方为肾，右为肝，左为脾胃，左上、右上均为肺，共 6 个穴点。

针刺方法：以25×13mm 粗细的毫针，由内向外以15-30°刺入2～4mm，针后不行捻转提插手法，每处留针30秒钟。每次心肝脾肺肾穴点均取，每次共治疗3分钟。

（4）失眠穴方［3］针刺组18只：给予针刺失眠方经穴治疗。

取穴：双侧神门、支沟、足三里、三阴交［2］。大鼠的神门在前肢内侧腕部横纹尺骨边缘，直刺1mm；三阴交在后肢内踝尖直上10mm，直刺5mm；足三里即后三里，在膝关节后外侧，在腓骨小头下约5mm处，直刺7mm；支沟穴在前肢外侧，距腕关节4.5mm左右的尺桡骨间，直刺1mm。针刺方法：以25×13mm粗细的毫针，刺入穴位相应的深度，针后行捻转角度90°以内90～180 次/分的高频小幅度捻转手法，每穴行30秒后出针，每次共治疗4分钟。

（5）脐内环合失眠穴方组17只：腹腔注射PCPΑ混悬液后，给予以上失眠方针刺加脐内环针刺治疗，每穴行30秒后出针，共治疗7分钟。

（6）安定组17只：于实验干预第1天开始，用安定片混悬液灌胃。给药方法：将安定（地西泮）片（上海信谊药厂有限公司），按成人催眠剂量10mg/天，用人和鼠给药剂量体表面积折算公式计算出应给予大鼠药剂量为0.92mg/kg，使用前溶于蒸馏水中，配制成水溶液备用，每次灌注1ml。

疗程：各组按各自方案干预，每天治疗1次，连续干预6天。

1.5 实验方案

（1）神经行为学测试。Morris水迷宫参照文献制作［4-5］。实验时，一摄像头置于水迷宫水池中央的上方约2m处，自动采集动物游泳图像，所收集信号直接输入计算机，由图像自动采集和分析系统（成都泰盟软件有限公司，TM-vision行为学实验系统）自动分析和处理，包括动物的逃避潜伏期、游泳路径、穿越原平台的次数、游泳路线的长度等参数。水迷宫实验方法与操作参考文献进行［5］。

（2）实验程序［5，6］。试验前1天，让动物在不含平台的水池中自由游泳90s（每次），上午及下午从2个入水点各训练各1次，使其熟悉迷宫环境。实验程序包括第1至第5天的隐蔽平台试验，第6天为探索试验，第7至第9天的反向试验及第10天的可视平台试验。探索试验当天只测量1次，记录时间为60秒s，余9天每天均测量2次，每次记录时间为90秒s，每次间隔2小时以上，取2次的算术平均值作为当日的学习成绩。

在实验针刺、给药过程中及数据离散度过大的数据予脱落处理，最后各组统计数据为正常组15只、模型组15只、脐内环针刺组14只、失眠穴方针刺组16只、脐内环合失眠穴方组15只和安定对照组14只。

1.6 数据处理与统计分析

2 实验结果

2.1 各组大鼠在水迷宫的平均潜伏期和穿越原平台的次数的实验数据

表1 各组大鼠在水迷宫的实验数据

2.2 神经行为学统计结果

2.2.1 隐蔽平台试验

在连续5天（表1第1天至第5天数据）的隐蔽平台试验中，双因素方差分析检验结果为F（5，87）=87.436，P≤0.01，所有 PCPΑ大鼠和正常组大鼠的逃避潜伏期均随训练天数的增加而明显缩短，学习成绩稳提高，反映三种针刺和安定片治疗和水迷宫的训练有显著性的改善 PCPΑ大鼠学习和记忆作用，交互作用检验为F（30，435）=0.683，P≥0.05，说明训练天数与组间因素没有交互作用；组间比较结果F（5，87）=6.329，P≤0.01，说明诸组间干预方法对学习记忆成绩有显著性差异。每个训练日组间比较发现：（1）PCPΑ模型组的平均潜伏期下降缓慢而正常对照组下降明显，于第3天二者就出现显著性差异；（2）脐内环穴合并失眠穴方组于第3天最早出现与PCPΑ模型组的显著性差，早于另4个干预组，此后差异稳定至第5天；（3）失眠穴方组、脐内环组及安定对照组均在第4天出现与PCPΑ模型组的显著性差异，但两个单一针刺干预疗效保持不稳定，于第5天消失，而安定组稳定维持这种差异。

2.2.2 反向试验

反向试验见表1第7天至第9天数据。在连续3天的反向试验中，双因素方差分析检验结果为F（5，87）=27.419，P≤0.01，所有 PCPΑ大鼠和正常大鼠的逃避潜伏期均随训练天数的增加，呈逐渐下降趋势，再学习成绩稳步提高，反映三种针刺、安定片治疗和水迷宫的训练有显著性的改善再学习作用；交互作用检验为F（25，261）=0.362，P≥0.05，说明训练天数与组间因素之间没有交互作用；组间比较结果F（5，87）=3.687，P≤0.01，说明诸组间干预方法对学习记忆成绩有显著性差异。每个训练日组间因素比较发现：（1）模型组的逃避潜伏期时间下降缓慢，而正常组下降较显著；（2）于第 8天，正常组与模型组组间比较出现统计学意义（P≤0.01），平均潜伏期时间更短，并稳定保持至第9天；（3）在第9天，脐内环穴合并失眠穴方组与模型组比较，组间也出现统计学意义（P≤0.01），平均潜伏期时间比更短，但和另二个单一针刺组没有显著性差异；（3）脐内环组、失眠穴方组分别与模型组比较，均未出现统计学意义。

2.2.3 空间探索试验

实验动物穿越原平台次数见表1第6天数据。单因素方差分析显示组间差异有统计学意义（F（5，58）=3.122，P≤0.05）；两两比较提示：正常对照组、脐内环合并失眠穴方组有更多的穿越原平台次数，统计显示分别优于与模型组（P≤0.01）和脐内环组（P≤0.05），正常对照组并且优于失眠穴方组（P≤0.05）。

2.2.4 可视平台试验

在空间训练的第10天最后进行。平均逃避潜伏期时间见表 1第 10天数据，单因素方差分析结果为 F（5，58）=0.181，P≥0.05，组间总差异无统计学意义，两两比较也无显著性差异。各组运动速度（cm/s）为：正常组 17.52±3.48，造模组16.85±3.01，脐针组16.94±2.40，失眠穴方组17.45±3.13，脐内环合失眠穴方组17.07±3.48，西药安定组17.25±3.39，单因素分析示，五组总体比较F（5，58）=0.112，P≥0.05，组间没有统计学意义；两两比较发现也发现有显著性差异。

3 讨论

失眠症多因某些长期的精神因素引起脑功能活动过度紧张，导致精神活动能力的减弱，既易于兴奋又易于疲劳，又常与焦虑抑郁互为因果。失眠动物模型常有神经行为学异常，神经行为学异常应是失眠动物模型的成功标志。王海棠［7］等证明原发性失眠和继发性失眠患者的空间工作记忆功能均有损害，抑郁因素（SDS）和失眠因素（PSQI）均对其有贡献，但抑郁的影响更大；继发性失眠患者再认记忆有负荷依赖性受损，二者均有感知记忆受损。多种有效治疗失眠的针灸疗法证明有改善失眠大鼠模型的这种神经行为学的异常。如胡晓辉［8］等证实 PCPΑ失眠大鼠模型在不同行为学检测方法中行为学变化趋势基本一致，而失眠模型大鼠中缝背核（DRN）galanin神经元变化与PCPΑ失眠病理发生、神经行为学变化相关的。韩岳珊［9］电项针项部风池、供血（颈4夹脊）等穴对学习记忆障碍的失眠模型大鼠有恢复学习记忆能力。然而目前较多针灸疗法的实验研究缺少或忽视其失眠模型的神经行为学基础研究，且缺少多种神经行为学检测方法的相互参考资料，如然，动物实验微观指标检测将很难让人信服地对应着解释人类失眠的机制。

脐内环针是黄瑾明新创的针法，是壮医针刺主要调气方法和基础针法，常采用脐内环针结合其他穴位或针灸经穴运用，广泛用于临床诸多病症，而脐内环穴的穴点选择常可按五脏点同取法应用。针刺失眠穴方源于广西中医药大学肖继芳教授多年来针刺治疗失眠症的经验方，取穴神门、三阴交、支沟、足三里，经近年针灸的挖掘整理而定方，临床疗效肯定［3］。近年来，在中医失眠穴方针刺和壮医针刺治疗失眠症［10］基础上，笔者将二者结合运用发展成了脐内环合失眠穴方针刺方法，临床观察有更可靠疗效、基础实验也显示一定的作用；然其研究尚处于起步阶段，本实验从 PCPΑ失眠大鼠模型模拟基础的神经行为学着手，以进一步机制研究。Morris水迷宫实验中，可视平台诸组间实验平均逃避期时间和平均速度统计，均无显著性差异，说明该水迷宫实验，组间动物基线处于同一水准，存在可比性。隐蔽平台实验主要反映模型动物的学习能力；结果提示：PCPΑ失眠大鼠存在空间记忆的学习能力损害，表现出认知功能损害，而脐内环针刺方法和失眠穴方针刺方法均显示有效改善这种认知功能损害，作用与安定口服法相当；而脐内环合失眠穴方针刺组出现疗效最早、稳定和持久，具有疗效优势。反向平台试验反映动物再学习能力；结果提示：PCPΑ失眠大鼠存在空间记忆再学习能力损害，脐内环穴针刺、失眠穴方针刺和安定给药方法均显示一定程度改善这种认识功能损害，但未产生显著性差异；只有二者合并方法才产生显著性差异，提高了再学习能力。探索试验主要反映动物学习的记忆保持能力；结果提示PCPΑ失眠大鼠也有记忆保留能力损害，脐内环针刺、失眠穴方针刺和安定给药方法增加穿越原平台的频次均无统计学意义，只有二者合并方法才产生显著性差异，提高了记忆保持能力，且明显优于单一的。综合实验结果可得出，PCPΑ失眠大鼠存在空间记忆的学习能力、再学习能力和记忆保留等全面障碍，失眠穴方针刺、脐内环穴针刺均能一定程度改善 PCPΑ失眠大鼠的学习、再学习能力和记忆保存能力，其改善认知功能作用与安定药物相当；而脐内环穴合失眠穴方针刺方法能较全面改善认知障碍各方面的功能，显示出二方合并的叠加作用，明显优于西药安定给药方法，是本实验的优选方法，适合失眠症临床推广的一种有效疗法。

推究脐内环穴合并失眠穴方针刺治疗失眠症取得最佳疗效的理由：二者结合体现了中医理论壮医理论协同的结合、“中”与“傍”部位的结合、整体和局部的结合、脏腑调节经络调节的结合以及脏腑气化气机经脉运行的有机结合，颇能针对失眠病因、症状，从而平衡机体阴阳、协调天地人三气同步，达到纠正失眠状态。故失眠穴方合脐内环穴针刺方法是实验优选和临床适宜推广运用的方法。

［1］ 黄瑾明，黄贵华，黄由之，等.壮医脐环穴及其临床应用［J］.中国针灸，2013，33（6）:561-564.

［2］ 李忠仁.实验针灸学［M］.北京:中国中医药出版社，2003: 327-329.

［3］ 罗本华.针刺失眠穴方治疗失眠症56例疗效观察［J］.辽宁中医杂志，2008，35（2）:274-275.

［4］ Morris R.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.Neurosci Methods，1984，11（1）:47-50.

［5］ Yu J，Liu C，Zhang X，Han J.Αcupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats［J］. Physiol Behav，2005，86（4）:434-441.

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［7］ 王海棠，陈贵海.失眠对空间和物体再认记忆的影晌［D］.合肥:安徽医科大学，2011.

［8］ 胡晓辉，李柱一.PCPΑ致失眠模型大鼠中缝背核 galanin阳性神经元的表达与 5-HT关系的研究［D］.西安:中国人民解放军第四军医大学，2010.

［9］ 韩岳珊，高维滨.电项针对失眠大鼠下丘脑内神经递质含量及学习记忆影响的实验研究［J］.黑龙江:黑龙江中医药大学，2008.

［10］ 罗本华，薛丽飞，覃斌宁，等.脐内环针与安定片治疗原发性失眠症61例观察［J］.针灸临床杂志，2014，30（11）: 8-11.

Control study of three kinds of acupuncture improving cognitive deficits in water maze of PCPA insomnia rats.

Objective: To study the cognitive dysfunction of PCPΑ insomnia rats and the effect of umbilical inner acupuncture on the cognitive functions of PCPΑ model rats and preferably perform acupuncture. Methods: Αfter screening， 50 rats of PCPΑ insomnia model were randomly divided into five groups: The model group， the umbilical inner acupuncture group， the acupoint-prescription of insomnia group， the combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription group， and the diazepam control group， and each group were 10. The other 10 normal rats were as the normal group. The umbilical inner acupuncture group was acupunctured at the five Zang points of umbilical inner acupoints， and the acupoint-prescription of insomnia group rats were stimulated on the insomnia prescription acupoints. The combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription group were acupunctured at above two groups’ acupoints. The diazepam control group were treated orally the drug diazepam， while the model group and the normal group were given no special treatment. Cognitive function was evaluated by the Morris water maze test. Results :（1） The data showed that PCPΑ insomnia rats displayed obvious impairments of learning， retention and relearning ability of cognitive function. （2） In the hidden platform experiment， the three acupuncture methods could improve the learning ability of the PCPΑ insomnia model rats. But the combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription showed the earliest， stable and durable efficacy， which showed its efficacy advantage. （3） In the reverse experiment and exploration test， among the three acupuncture methods， only the combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription could significantly improve re-learning ability and memory retention ability of the PCPΑ insomnia rats in statistics. （4） In visual platform， the six group were no difference in the average incubation period and the average speed. Conclusion:The results suggested that the PCPΑ insomnia rats exist overall cognitive dysfunction. To some extent， the umbilical inner acupuncture method and the acupoint-prescription of insomnia method could improve cognitive dysfunction in PCPΑ insomnia rats， and their roles were fairly to that of the drug diazepam. The combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription could improve the overall cognitivedysfunction of PCPΑ insomnia rats， and it was significantly better than the drug diazepam. So， it was the experiment preferred method.

PCPΑ insomnia rats； cognitive function； umbilical inner acupoints； acupuncture of insomnia prescription acupoints；diazepam

R254

Α

1008-1151（2016）06-0057-04

2016-05-08

广西卫计委科研课题（GZLC16-29）；广西中医药大学重大课题（ZD12005）。

罗本华（1968-），广西中医药大学主任医师，博士，研究方向为针灸与壮医防治神经系统及老年性疾病基础与临床研究。