炖煮鸡汤中多肽与鲜味构效关系

林萌莉，王 洁，廖永红，周晓宏,*

（1.北京理工大学生命学院，北京 100081；2.北京工商大学食品学院，北京 100048）

炖煮鸡汤中多肽与鲜味构效关系

林萌莉1，王 洁1，廖永红2，周晓宏1,*

（1.北京理工大学生命学院，北京 100081；2.北京工商大学食品学院，北京 100048）

以传统炖煮鸡汤为对象，研究多肽与鲜味之间的构效关系。将炖煮3 h的鸡汤利用10、5、3 kD的超滤膜分离，取味道鲜美的分子质量小于3 kD的组分进行高效液相色谱-质谱法多肽组分分析，获得了93 条多肽序列。通过分析发现：加热降解产生的多肽序列中甜鲜氨基酸的比例高，强疏水性氨基酸的比例低；加热降解过程中肽键断裂具有选择性，亲水氨基酸形成的肽键更易断裂。鲜味多肽主要来源于肌肉蛋白，其次是胶原蛋白、酶、抗体等活性成分。

鸡汤；多肽；鲜味；亲水性氨基酸；疏水性氨基酸

鲜味是5 种基本味觉之一，深受东方人的喜爱。近代以前，鲜味食品是由蛋白含量丰富的食料通过炖煮或发酵方法制备的，如肉汤、蔬菜汤、酱油、豆腐乳等[1-2]。1908年，日本东京帝国大学教授池田菊苗发现了海带汤鲜美的味道源自于谷氨酸钠[3]。20世纪50年代末，谷氨酸钠通过发酵方法实现了大规模工业化生产[4]。1960年，研究者发现5’-鸟苷酸（guanosine 5’-monophosphate disodium salt，GMP）和5’-肌苷酸（inosine 5’-monophosphate disodium salt，IMP）按比例混合在一起，具有特殊的鲜味，出现了鲜味产品I＋G[5]。20世纪90年代，鸡精产业出现并取得长足发展，鸡精在一定程度上体现了肉的香气和鲜味口感。由于味精、I＋G、鸡精等鲜味工业产品成分单一、鲜味强烈直冲且缺乏营养，消费者更需要类似传统肉汤、酱油等口感柔和、营养丰富的鲜味产品。然而，传统方法原料利用率低、生产效率低，能源消耗高，人工成本压力大。因此，研究传统鲜味食品的鲜味形成机理和规模化工业生产技术已成为当前鲜味产业的迫切需求[6]。

传统方法制备的肉汤、酱油等的主要鲜味成分是蛋白降解产生的多肽及氨基酸[7-9]。多肽在柔和协调的鲜味中具有非常重要的作用，是国内外的研究热点。1969年，多肽的呈味特性引起人们的关注[10]。1978年，Yamasaki等[11]采用木瓜蛋白酶酶解牛肉后，从酶解液中获得美味提升肽：Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala。Noguchi[12]和Rhyu[13]等利用质谱分析从蛋白酶解物中分析获得鲜味肽，发现鲜味主要存在于一些低分子质量的酸性多肽中。Maehashi等[14]分别利用不同的酶对蛋白质进行酶解，发现11 条多肽，其中，Glu-Glu、Glu-Val、Ala-Asp-Glu、Ala-Glu-Asp、Asp-Glu-Glu等在含有0.02%的肌苷酸的溶液中能够提升鲜味效果。Gómez-Ruiz等[15]在酪蛋白中发现了许多鲜味肽，发现多肽中的氨基酸组成及氨基酸在多肽中的位置对于多肽的呈味特性具有非常重要的影响。Su Guowan等[16]通过超滤、反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）等分离方法对脱脂花生酶解物进行分析，发现了一条鲜味肽Ser-Ser-Arg-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg和一条鲜味增强肽Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Pro-Asp-Gly-Ser-Ser-Arg。组成多肽的氨基酸与味觉受体的相互作用会影响多肽的呈味特性[17]。Ishibashi等[18-19]合成含有疏水性氨基酸的短肽并对其进行研究，发现多肽的苦味强度与疏水性氨基酸的比例及在多肽中的位置有关，疏水性氨基酸残基比例高的多肽苦味强度较高[20]。Tamura[21]和Rhyu[13]等发现含有谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）的低分子质量酸性多肽具有鲜味。

综上所述，以往鲜味多肽的研究都是针对单一或少数几条多肽，但是，肉类炖煮食品的鲜味口感不只是由一种或若干种多肽呈现的，而是由肉类蛋白加热降解形成的各种多肽呈现的[22]。本实验利用传统炖汤方法制备鸡汤，通过超滤、高效液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrum，HPLCMS）等分离分析手段研究鸡汤中多肽与鲜味之间的构效关系，以期为工业化制备具有传统炖汤烧肉鲜味的新型鲜味调味品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

三黄童子鸡 北京超市发超市双榆树分店。

1.2 仪器与设备

AL204-IC分析天平、Vivaspin 6离心浓缩管德国Sartouris公司；TDL-50B型离心机 上海安亭科学仪器厂；DIONEX UltiMate 3000 RSLC液相色谱仪、Q-Exactive质谱仪（Xcalibur 2.2数据处理系统） 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 鸡汤制备与处理

新鲜三黄鸡洗净之后，去尾脂腺，分割头、颈、爪、腿、翅，鸡身架切成5 cm×5 cm左右方块，按质量比1∶3往炖锅中加入蒸馏水，浸没过鸡块，大火将鸡汤煮沸之后微火慢炖3 h。汤汁用10 cm×20 cm，密度30×28的4 层纱布二次过滤，3 000 r/min离心20 min之后，取上层液体在4 ℃冰箱内密封静置一星期后，使脂肪和汤体充分分离，再用两层7 cm的双圈中速定性滤纸过滤保存。静置前后鸡汤风味，氨基态氮含量无明显变化，静置后检测不到蛋白酶酶活力，说明鸡汤静置前后多肽的变化可以忽略。

1.3.2 超滤分析与风味评估

鸡汤样品在4 000 r/min条件下离心10 min后，收集上清液。分别用0.45、0.22 øm水相滤膜对上清液进行微滤。获得的微滤液再利用截留分子质量为10、5、3 kD的超滤离心管在3 000×g条件下进行20 min的超滤离心。取一定量的鸡汤原液及不同截留分子质量的超滤液进行真空冻干称量，4 ℃保存备用。利用质量分数为0.9%的NaCl溶液溶解干粉，根据王春叶[23]和Frank[24]等报道的滋味稀释分析法分析。

1.3.3 多肽序列分析

通过滋味稀释分析发现鸡汤中的鲜味物质分子质量主要集中在3 kD以下，和原鸡汤的味道相似。因此选取分子质量小于3 kD的超滤组分进行多肽序列分析。取1 mL样品，12 000×g离心15 min，取上清液，冷冻挥干，用质量分数0.1%的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）复溶。样品在0.3 øL/min流速条件下梯度洗脱分离65 min。分离装置为液相色谱仪与质谱仪直接相连，构成液相色谱-质谱联用系统。分析柱为熔融石英毛细管柱（150 mm×75 øm；Upchurch），将其与C18树脂（300 Å，5 øm；Varian）组合形成自制分析柱，流动相A为体积分数0.1%甲酸，流动相B为体积分数80%的乙腈和体积分数0.08%的甲酸，质谱分析使用单一的全扫描质谱Orbitrap（质量扫描范围 400～1 500；分辨率140 000），并通过Xcalibur2.2软件采集数据。HPLC-MS分析图谱检索国家国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库，获得多肽序列。

2 结果与分析

2.1 鸡汤多肽序列分析

将分子质量小于3 kD的组分进行MS多肽序列分析，总共获得了93 条多肽序列，结果如表1所示。对93 条多肽进行统计，发现多肽最大分子质量为2 884 D，最多含有28 个氨基酸残基。其中超过50%多肽序列中含有的氨基酸残基数小于10，说明分子质量小于3 kD组分中含有的鲜味肽是一些低分子质量的多肽。Fadda等[25]也发现蛋白降解产生的低分子质量的肽与食品的鲜味有关。

表1 鸡汤中小于3 kD的多肽序列Table1 Peptide sequences of the fraction (MW< 3 kD) in chicken broth

2.2 多肽中甜鲜氨基酸分布

在多肽中，不同呈味氨基酸的组成对于多肽呈味特性具有很重要的影响[17]。根据表1多肽序列信息计算甜鲜氨基酸（Asp、Glu、Gln、Asn、Ala、Gly、Thr、Ser）占各自多肽总氨基酸的比例，并将甜鲜氨基酸比例划分为8 个区间，分别是0～9.9%、10%～19.9%、20%～29.9%、30%～39.9%、40%～49.9%、50%～59.9%、60%～69.9%、70%～79.9%，并统计各个区间中的多肽条数。如图1所示，93 种序列中甜鲜氨基酸比例在30%～80%的多肽数为74 条，且近半数序列中甜鲜氨基酸的比例超过50%，说明含有高比例甜鲜氨基酸组成是小于3 kD组分中多肽呈鲜味的关键因素之一。

图1 甜鲜氨基酸的比例分布Fig.1 Distribution of sweet and umami amino acids

2.3 多肽疏水性氨基酸分布

苦味氨基酸（Lys、Arg、Tyr、Ile、Leu、Val、Phe、Trp）多是一些疏水性氨基酸，疏水性氨基酸在多肽中的组成及位置都会影响多肽风味[20]。93 种序列中只有19%多肽序列的C末端为疏水性氨基酸，超过70%多肽序列中疏水性氨基酸的比例不超过50%。根据氨基酸疏水性的高低，疏水性值高于0.8的Ile、Leu、Val、Phe、Trp归类为强疏水性氨基酸，低于0.8的Ala、Met、Pro等归类为低疏水性氨基酸[26]。强疏水性的氨基酸的比例较低，一般在0～20%之间。说明鸡肉蛋白在热解的过程中，倾向于将低疏水性的肽段热切下来。Normah等[27]指出疏水性氨基酸对多肽苦味具有重要作用，苦味的强弱与疏水性氨基酸分布位置有关。肽的C末端如果是疏水性氨基酸，多肽会呈现苦味。在蛋白加热过程中，可能由于疏水性氨基酸在蛋白质内部形成了疏水核心，不易暴露出来并被降解。而蛋白酶解过程中，易于形成疏水性多肽，所以会呈现苦味[28]。分子质量小于3 kD鸡汤组分中极少数多肽序列中疏水性氨基酸占的比例较高，这些多肽在鲜味口感中也起着重要作用，使鲜味更柔和，同时也保证了鸡汤中必需氨基酸的营养价值。

2.4 肽键热分解的选择性

疏水性氨基酸分布结果发现，肽键的末端不是随机分布的，而具有一定的规律性，表明键的热分解不是随机的。对93 种多肽序列进行比较，对来源于蛋白的同源肽段热切位点进行分析，统计出21 种不同的多肽的热切位点，结果见表2。21 个推测的肽键热切位点左侧（N端）均不含强疏水性氨基酸，而在肽键右侧（C端）出现5 次强疏水性氨基酸，N端、C端均为亲水或低疏水性氨基酸的肽键切点所占比例为76.2%，N端为亲水性或低疏水性氨基酸、C端为强疏水性氨基酸的肽键切点所占比例为23.8%，而在肽键N、C端均为强疏水性氨基酸的情况基本不存在。统计发现肽键热切具有这样的选择性：亲水肽键（亲水氨基酸-亲水氨基酸）在受热情况下最先断裂；半亲水肽键（亲水氨基酸-疏水氨基酸、疏水氨基酸-亲水氨基酸）根据疏水氨基酸所在位置不同具有不同的热切选择性，其中疏水性氨基酸位于肽键左侧（N端）不利于肽键发生热切作用，但从整体热切选择性来说，半亲水肽键比亲水肽键热切作用要差很多；疏水肽键（疏水性氨基酸-疏水性氨基酸）热切作用最低，当肽键两侧氨基酸残基具有强疏水性时，肽键基本不发生热切作用。

表2 同源多肽的热切位点Table2 Cleavage sites of the homologous polypeptides

2.5 鸡汤鲜味肽组织来源

根据鲜味肽序列Gi号，统计各种多肽的组织来源。将鸡肉组织分为4 类：肌肉蛋白组织、胶原蛋白组织、活性成分及其他组织。通过统计分析发现58%的多肽来源于肌肉蛋白，12%的多肽来源于胶原蛋白，14%的多肽来源于酶、抗体等活性蛋白成分，另外16%多肽来源于其他组织。除了动物体的肌肉蛋白以外，胶原蛋白和活性蛋白成分对肉汤的风味具有重要贡献。

3 结 论

多肽在食品的鲜味呈味特性中具有非常重要的作用，鲜味多肽主要为分子质量小于3 kD的小分子多肽。在分析获得的93 条多肽序列中，疏水性的氨基酸含量较低，C末端基本上不是强疏水性的氨基酸，与苗晓丹等[20]研究发现的苦味肽与疏水性氨基酸之间关系的结论一致。但是，他们发现鲜味肽中Asp、Glu的比例较高，并从一级结构的角度解析了多肽与鲜味之间的构效关系。而本研究通过对炖煮鸡汤中的多肽序列分析发现甜味氨基酸也是多肽呈鲜味的关键因素之一。从蛋白质结构整体分析，疏水性氨基酸在蛋白质内部形成了疏水核心，加热时表面的亲水性氨基酸残基组成的多肽先断裂下来，所以，鸡汤多肽疏水性氨基酸残基的比例较低。肽键的断裂具有选择性，亲水肽键最易断裂。蛋白加热降解形成的鲜味多肽主要来源于肌肉蛋白，其次是胶原蛋白及其他的一些活性成分。

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Structure-Acivity Relationship between Peptides and Flavor in Chicken Broth

LIN Mengli1, WANG Jie1, LIAO Yonghong2, ZHOU Xiaohong1,*
(1. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China; 2. School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The structure-activity relationship between peptides and flavor was studied on chicken broth made by the traditional cooking process. The chicken broth stewed for three hours was fractionated using ultrafiltration membranes with molecular weight cut-offs of 10, 5 and 3 kD. The peptidomics in the fraction (molecular weight < 3 kD) which had the strongest umami taste were analyzed by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS). Totally 93 peptides with high proportion of umami and sweet amino acids and low proportion of hydrophobic amino acids were sequenced. Peptide bonds with hydrophilic amino acids were preferentially cleaved during the heating process. The peptides were mainly derived from muscle proteins, collagens, enzymes and antibodies.

chicken broth; peptide; umami; hydrophilic amino acids; hydrophobic amino acids

10.7506/spkx1002-6630-201603003

Q819

A

1002-6630（2016）03-0012-05

林萌莉, 王洁, 廖永红, 等. 炖煮鸡汤中多肽与鲜味构效关系[J]. 食品科学, 2016, 37(3): 12-16. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603003. http://www.spkx.net.cn

LIN Mengli, WANG Jie, LIAO Yonghong, et al. Structure-acivity relationship between peptides and flavor in chicken broth[J]. Food Science, 2016, 37(3): 12-16. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603003.http://www.spkx.net.cn

2015-03-13

“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAD23B01）

林萌莉（1990 —），女，硕士研究生，研究方向为生物工程。E-mail：15965102575@163.com

*通信作者：周晓宏（1965 —），男，副教授，博士，研究方向为生物工程。E-mail：zhouxh@bit.edu.cn