α-突触核蛋白与血红蛋白复合物的形成可致线粒体中血红蛋白减低

杨巍巍　李旭冉　李　昕　李旭颖 　于　顺,3*

(1.首都医科大学宣武医院神经生物学研究室，北京 100053；2.帕金森病研究北京重点实验室，北京 100053；3.北京脑重大疾病研究院帕金森病研究所，北京 100053)



· 基础研究 ·

α-突触核蛋白与血红蛋白复合物的形成可致线粒体中血红蛋白减低

杨巍巍1,2李旭冉1,2李昕1,2李旭颖1,2于顺1,2,3*

(1.首都医科大学宣武医院神经生物学研究室，北京 100053；2.帕金森病研究北京重点实验室，北京 100053；3.北京脑重大疾病研究院帕金森病研究所，北京 100053)

目的比较不同年龄段食蟹猴中α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)与脑血红蛋白(neuronal hemoglobin, nHb)复合物在不同亚细胞中的形成。方法免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测α-syn与nHb复合物在不同年龄段食蟹猴不同脑区亚细胞结构中的表达，免疫印迹(Western blotting)法检测食蟹猴不同亚细胞结构中游离α-syn与nHb的表达。结果在纹状体中，nHb-α-syn复合物在胞质组分中存在增龄性增加，而在线粒体组分中存在增龄性减低，并且在纹状体中，线粒体中游离nHb随年龄增加而表达减少(P<0.05)；在青、中、老年食蟹猴小脑中，nHb-α-syn复合物在胞质及线粒体组分中并无明显变化。同时，线粒体中游离nHb不随年龄增加发生改变。结论在老化脑的易感区，α-syn与nHb复合物的形成可致线粒体游离nHb降低。

α-突触核蛋白；血红蛋白；老化；线粒体

脑老化的特征性标志物是纤维蛋白包涵体如路易体(Lewy body，LBs)及路易神经突(Lewy neurites，LNs)的形成[1-2]。α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)是LBs的主要成分，是公认的与老化及帕金森病(Parkinson’s disease PD)发生发展密切相关的蛋白[3-4]。尽管近年来对α-syn的研究取得很多新进展，但其参与老化及PD的病理生理机制尚不明确。近来文献[5-7]报道α-syn可以与其他蛋白如受体、转运体及酶等发生相互作用从而参与了α-syn的病理机制。同时，很多蛋白与α-syn共定位于LBs中[8]。

脑血红蛋白(neuronal Hb，nHb)属于神经球蛋白家族的一员，主要生理作用为维持线粒体正常功能[9-15]。同时，文献[16]报道nHb在PD患者脑中表达异常。例如，nHb在PD患者黑质多巴胺能神经元中表达降低并伴随α-syn沉积[17]。但是，α-syn与nHb是否存在相互作用尚不明确。老化是PD发病的危险因素之一[18]。在老化脑中，同样观察到α-syn的聚集并伴随nHb在线粒体的降低[19]。本文主要观察不同年龄段食蟹猴不同脑区亚细胞结构中α-syn与nHb的相互作用，可能为阐明PD选择性损伤的病理机制提供一定的理论依据。

1　材料和方法

1.1材料

健康食蟹猴(4～16岁)12只，购自广西雄森灵长动物养殖中心，实验动物许可证号：SYXK(桂)2009～0006， 所有动物均有详细出生档案和检疫证书，动物研究方案经动物福利委员会(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)认证批准。青年猴4只(4岁)，中年猴4只(10～11岁)，老年猴4只(15～16岁)。鼠抗人Hb单克隆抗体(Abcam公司，美国)；鼠抗人α-syn单克隆抗体3D5由本室制备；生物素化的鼠单克隆抗体3D5(康为世纪标记)；4-硝基磷酸二钠盐(Sigma公司，美国)；HRP标记山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(中杉金桥生物技术有限公司)；ELISA 96孔酶标板(Corning公司，美国)；酶标仪(Tecan公司，瑞士)；其他试剂为分析纯。

1.2方法

1)不同年龄段食蟹猴脑组织蛋白样品制备：抽提青、中、老年食蟹猴纹状体与小脑的胞质、线粒体及包膜组分，BCA法蛋白定量，-20 ℃保存备用。

2)与血红蛋白结合的α-syn的酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测：用2 mg/L 血红蛋白单抗包被96孔酶标板，2.5%(质量浓度)明胶封闭2 h。加入猴脑组织样品，37 ℃孵育2 h，再加入生物素标记3D5抗体 (终质量浓度1 mg/L)，37 ℃孵育2 h。向各孔加入100 mL碱性磷酸酶标记的亲和素 (1∶5 000)，37 ℃孵育1 h。以上每一步骤之后用PBST洗涤各孔4次。最后加入100 mL对硝基酚磷酸显色液 (pNPP)，37 ℃显色30 min。405 nm处测定吸光度值。

3)与血红蛋白结合的α-syn免疫共沉淀检测：将猴脑组织匀浆20 mg/L与7 mg/L的抗人红蛋白抗体于4 ℃孵育过夜，然后与protein A 反应，12 000 g离心5 min，弃上清，再加入0.01 mol/L PBS缓冲液500 mL，12 000 g离心5 min后，弃上清，将沉淀用抗α-syn抗体进行α-syn检测，以分析不同组食蟹猴不同脑区与血红蛋白结合的α-syn的质量分数。

4)免疫印迹分析：分别取20 μg各组蛋白样品用10%质量分数 SDS-PAGE分离后，半干法转移至PVDF膜。将PVDF膜与3D5单抗 (1∶5 000)，Hb(1∶1 000)，Actin (1∶1 000)，VDAC(1∶1 000)，calnexin(1∶1 000)室温孵育3 h，然后与辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠(或兔)IgG多克隆抗体(1∶5 000)室温孵育1 h。ECL法检测辣根过氧化酶活性。

1.3统计学方法

2　结果

2.1检测与Hb结合的α-syn的ELISA标准曲线的建立

免疫共沉淀及Western blotting结果显示，α-syn与Hb存在相互作用(图1A)。本课题组建立的检测Hb-α-syn复合物的ELISA方法，可以较特异地识别样本中与血红蛋白结合的α-syn，而在含有单体α-syn溶液中，仅能检测到极低的信号(图1B)。并且此种ELISA方法也可以用于检测脑组织样品，而阴性对照及空白对照均无信号出现(图1C)。

2.2不同年龄段食蟹猴不同脑区nHb与α-syn变化

Western blotting结果显示，在纹状体中，α-syn在细胞质表达，线粒体及包膜部位都存在增龄性增加(P<0.05)，而nHb在胞质的表达在青年、中年、老年3组食蟹猴中并无显著变化；但是在线粒体的表达则随年龄增加而减少(P<0.05，图2A～2C)。在小脑中，α-syn表达在线粒体及包膜部位都存在增龄性增加(P<0.05)，但其胞质表达水平在青年、中年、老年3组食蟹猴中差异无统计学意义。而胞质与线粒体组分中nHb表达也不随年龄发生改变(图2 D～2F)。

图1　与Hb结合的α-syn的ELISA标准曲线的建立

图2　食蟹猴不同脑区nHb与α-syn表达的变化

2.3不同年龄段食蟹猴不同脑区nHb-α-syn复合物形成改变

Western blotting法与ELISA结果显示在纹状体部位，与nHb结合的α-syn在胞质组分呈年龄依赖性增加(P<0.05，图3A)，而在线粒体组分则随年龄增加而降低(P<0.05，图3A)。在小脑部位，nHb-α-syn复合物在胞质及线粒体组分中均不随年龄增加而发生变化(图3B)。

图3　食蟹猴不同脑区胞质、线粒体及胞膜组分中nHb-α-syn复合物的检测

3　讨论

利用本室制备的α-syn单克隆抗体(3D5)作为检测抗体，利用Hb单克隆抗体作为捕获抗体，笔者建立了可以检测与Hb结合的α-syn的ELISA方法。并发现其只能检测与Hb结合的α-syn，提示此法有较高的特异性。

本研究发现了nHb-α-syn复合物存在于食蟹猴不同脑区，并且存在年龄依赖性变化，这个现象有可能阐明了老化脑敏感部位线粒体中nHb降低的原因。在食蟹猴纹状体中，本课题组发现线粒体中Hb-α-syn复合物随年龄增加而降低，而胞质中复合物则呈增龄性增加的趋势。并且本课题组同时发现线粒体中nHb在老年组食蟹猴中降低显著，而α-syn胞质和线粒体组分则显著增加。但是，在小脑中，nHb与Hb-α-syn复合物水平在胞质及线粒体组分中则无明显增龄性变化。由此，推测胞质中α-syn的聚集有可能是线粒体nHb减少的主要原因。

nHb在线粒体和胞质中呈动态平衡分布。而在胞质中积聚的α-syn可致胞质nHb-α-syn复合物增多并减少nHb从胞质转移到线粒体，从而使线粒体中游离nHb与nHb-α-syn复合物减低。尽管线粒体中积聚的α-syn可致线粒体nHb-α-syn复合物增多进而减少nHb，但是这并不是nHb在线粒体中增龄性减低的主要原因。因为在小脑中，线粒体中α-syn的增加并不伴随游离nHb的降低。

文献[10]报道nHb可定位于线粒体并缓解鱼藤酮所致线粒体的损伤。而本课题组研究发现，在食蟹猴敏感脑区nHb通过与α-syn形成复合物，从而导致线粒体中nHb增龄性降低，本研究为PD选择性损伤的机制提供了一定的理论基础。

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编辑孙超渊

， E-mail：yushun103@163.com

Neuronal hemoglobin in mitochondria is reduced by forming a complex with α-synuclein

Yang Weiwei1,2, Li Xuran1,2, Li Xin1,2, Li Xuying1,2, Yu Shun1,2,3*

(1.DepartmentofNeurobiology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China；2.KeyLaboratoryofNeurodegenerativeDisease,MinistryofEducation,Beijing100053,China；3.CenterforParkinson’sDisease,BeijingInsitituteforBrainDisorders,Beijing100053,China)

ObjectiveIn this study, we observed whether α-synuclein (α-syn) and neuronal hemoglobin (nHb) formed a complex in different subcellular pool of brain regions in aging cynomolgus monkeys. MethodsThe levels of nHb-α-syn complex were detected in different subcellular pools of different regions in aging monkey brains using co-immunoprecipitation (Co-IP) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expressions of free α-syn and nHb were detected in different subcellular pools of aging monkey brains by Western blotting. ResultsIn the striatum, cytoplasmic nHb-α-syn complex increased with age, while mitochondrial nHb-α-syn complex decreased with age and was accompanied by a reduction in mitochondrial free nHb (P<0.05). In contrast, no changes in nHb-α-syn complex formation or free nHb levels were detected in the cerebellum in young, middle age and aged monkey brains. ConclusionThe above results suggest that α-syn forms a complex with nHb in selected regions of the aging brain.

α-synuclein (α-syn)；hemoglobin；aging；mitochondria

国家重点基础研究发展计划(2011CB504101)，国家自然科学基金(81071014, 81371200，81401042)，国家科技支撑计划课题(2012BAI10B03)，首都卫生发展科研专项课题(2011-4001-01)，北京市自然科学基金(7122035)。 This study was supported by National Basic Research Program (“973” Program) of China (2011CB504101), National Natural Science Foundation of China (81071014, 81371200, 81401042), National Science and Technology Support Program (2012BAI10B03), Capital Health Research and Development Special Fund (2011-4001-01), Natural Science Foundation of Beijing (7122035).

时间：2016-10-1610∶58

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1058.034.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.013]

R 338

2016-01-29)