鉴别诊断临床急性肺炎病原体感染的血清标志物研究

刘　萌　窦云鹏　谷　丽　吕　喆　王一民　刘颖梅　安云庆* 　曹　彬2,*

(1.首都医科大学附属北京朝阳医院感染与临床微生物科　北京呼吸疾病研究所，北京 100020；2. 首都医科大学呼吸病学系，北京 100069；3. 首都医科大学免疫学系　首都医科大学微生态研究中心，北京 100069； 4. 中日友好医院呼吸与危重症医学科二部，北京 100029)



· 基础研究 ·

鉴别诊断临床急性肺炎病原体感染的血清标志物研究

刘萌1,2窦云鹏3谷丽1吕喆3王一民4刘颖梅4安云庆3*曹彬2,4*

(1.首都医科大学附属北京朝阳医院感染与临床微生物科北京呼吸疾病研究所，北京 100020；2. 首都医科大学呼吸病学系，北京 100069；3. 首都医科大学免疫学系首都医科大学微生态研究中心，北京 100069； 4. 中日友好医院呼吸与危重症医学科二部，北京 100029)

目的 检测急性肺炎患者血清相关生物标志物含量，为建立一种快速鉴别诊断临床急性支原体肺炎、病毒性肺炎、细菌性肺炎的免疫胶体金检测法提供实验依据。 方法以临床病原学诊断明确的急性支原体肺炎，病毒性肺炎，细菌性肺炎患者和正常人血清为检测样品，采用血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)/杀菌渗透增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测试剂盒检测上述血清中相关生物标志物含量。 结果(1)正常人群血清78份，急性支原体肺炎患者血清46份，病毒性肺炎和细菌性肺炎患者血清42份，其中病毒感者患者血清35份，细菌感染患者血清7份；(2)正常人群血清PDGF最大值<6 000 pg/mL； 血清BPI最大值<80 ng/mL；(3)以血清PDGF值6 000 pg/mL作为鉴别诊断急性支原体感染的基线值，支原体感染患者阳性检出率为93.47%(43/46)；病毒和细菌感染患者出现支原体感染的假阳性率为7.14%(3/42)；(4)以血清BPI值80 ng/mL作为鉴别诊断急性细菌感染的基线值，细菌感染患者阳性检出率为85.71%(6/7)；病毒感染患者出现细菌感染的假阳性率为3.22% (1/31)。结论以血清PDGF 6 000 pg/mL和BPI 80 ng/mL作为鉴别诊断不同病原体感染的基线值，对临床急性支原体肺炎、病毒性肺炎、细菌性肺炎鉴别诊断具有一定意义。

肺炎; 鉴别诊断; 血小板衍生生长因子; 杀菌渗透增强蛋白

在临床急性呼吸道感染患者中，支原体感染所占比例最大，病毒次之，细菌最低[1]。在上述病原体中，细菌对青霉素和头孢菌素类抗生素敏感；支原体对红霉素和螺旋霉素类抗生素敏感；而病毒感染用上述抗生素治疗无效。现有实验室诊断技术存在不能及时准确鉴别诊断上述相关病原体的缺陷。 临床医生通常多采用经验性抗生素治疗，这不仅容易造成抗生素使用不当导致细菌耐药，还可因未能及时合理使用抗生素而使某些患者，特别是婴幼儿患者病情迅速恶化产生严重后果[2]。

目前临床常用的血清炎性指标主要包括C-反应蛋白(C reactive protein，CRP)和降钙素原(procalcitonin，PCT)。最初发现急性细菌感染患者血清CRP浓度显著升高，后来发现在某些病毒感染患者血清中CRP浓度也显著升高。故患者血清CRP浓度升高对急性细菌或病毒感染仅有一定的辅助诊断意义[3]。 PCT血清浓度升高对临床重症细菌感染的诊断和指导抗生素的合理使用具有重要意义[4-5]，而对临床轻症细菌感染与病毒或支原体感染没有鉴别诊断价值。因此，在急性呼吸道感染患者血清中找到对不同病原体感染具有鉴别诊断意义的生物标志物，建立一种快速、简便、准确有效的检测方法，对指导及时合理使用抗生素有效控制患者病情和减少耐药菌产生有重要意义。

为此，本课题组以临床病原学诊断明确的急性支原体、病毒性肺炎、细菌性肺炎患者和正常健康人血清为检测样品，采用血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)/杀菌渗透增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测试剂盒对上述血清样品中相关生物标志物进行检测。

1　材料与方法

1.1研究对象和检测样品

选择2010年9月至2012年6月北京肺炎监测网病原学诊断明确的门诊或住院成人急性肺炎患者88例；其中急性细菌性肺炎患者血清7份，急性病毒性肺炎患者血清35份，急性支原体肺炎患者血清46份作为检测样品。选择首都医科大学2015年入学新生(18～19岁)体检剩余血清78份作为正常对照样品。

1.2检测方法

首先采用Bio-Plex悬液芯片技术对部分患者血清样品进行检测，寻找具有鉴别诊断意义的候选生物标志物，然后采用ELISA试剂盒对包括急性肺炎患者和正常对照组人群在内的所有血清样品进行检测。PDGF试剂盒(购自eBioscience公司)，参照操作说明对血清样品中PDGF的浓度进行检测；BPI试剂盒(购自Hycult Biotech 公司)参照操作说明对血清样品中BPI含量进行检测。

2　结果

2.1正常健康人群组

正常健康人群组血清样品78份，检测结果：(1)PDGF值：186～5 521 pg/mL，最大值<6 000 pg/mL；(2)BPI值：1～49 ng/mL，最大值<80 ng/mL。

2.2急性细菌性肺炎组

急性细菌性肺炎患者血清样品7份，检测结果：(1)PDGF值：489～7 930 pg/mL，其中6份血清样品PDGF值<6 000 pg/mL，1份血清样品PDGF值为7 930 pg/mL。(2)BPI值：40～349 ng/mL，其中6份血清样品BPI值>80 ng/mL， 1份血清样品BPI值为40 ng/mL，详见表1。

表1　急性细菌性肺炎患者血清中PDGF和BPI检测结果

PDGF：platelet-derived growth factor; BPI：bactericidal/permeability-increasing protein.

2.3急性病毒性肺炎组

急性病毒性肺炎组血清样品35份，检测结果：(1)PDGF值：530～11 865 pg/mL，其中33份血清样品PDGF值<6 000 pg/mL，2份血清样品PDGF值>6 000 pg/mL。(2) BPI值(31份)：12～88 ng/mL， 其中30份血清样品BPI值<80 ng/mL，1份血清样品BPI值>80 ng/mL，详见表2。

2.4急性支原体肺炎组

急性支原体肺炎组血清样品46份，检测结果：(1)PDGF值：2 786～39 438 pg/mL，其中43份血清样品PDGF值>6 000 pg/mL，3份血清样品PDGF值<6 000 pg/mL。(2) BPI值(42份)：22～264 ng/mL，其中25份血清样品BPI值>80 ng/mL，17份血清样品BPI值<80 ng/mL，详见表3。

表2　急性病毒性肺炎患者血清中PDGF和BPI检测结果

PDGF：platelet-derived growth factor; BPI：bactericidal/permeability-increasing protein.

表3　急性支原体肺炎患者血清中PDGF和BPI检测结果

PDGF：platelet-derived growth factor; BPI：bactericidal/permeability-increasing protein.

3　讨论

血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是参与机体组织损伤修复的重要因子[6]。研究[7-8]发现，PDGF升高与肺、肝、骨髓纤维化和动脉粥样硬化等疾病的发生密切相关。 肺炎支原体反复感染的大鼠肺组织中PDGF浓度显著升高，并由此导致肺间质纤维化形成的研究[9-10]报道，提示支原体感染与体内PDGF水平升高存在一定的相关性。杀菌渗透增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)是一种具有中和内毒素和广谱杀菌作用的阳离子蛋白[11-12]，主要存在于中性粒细胞和黏膜上皮细胞中；细菌感染后患者血清BPI浓度显著升高[13]。

PDGF和BPI作为一种参与机体组织损伤修复、诱导促进组织纤维化形成的细胞因子和一种抗菌蛋白或抗感染生物制剂受到医学界的重视。但迄今尚未发现将PDGF和BPI作为一种急性感染生物志志物，用以鉴别诊断不同病原微生物感染的研究。

免疫胶体金检测法是一种快速定性诊断的技术。在此基础上制备的免疫胶体金试纸卡检测试剂盒不仅具有快速(1 h内)诊断的特点，还具有测试准确性高，操作简便，结果容易判读，适合在城乡基层医疗单位推广使用的优点[14-15]。建立免疫胶体金检测方法的核心问题是能够找到相关生物标志物，并准确获得该生物标记物对相关疾病具有鉴别诊断意义的基线值。

根据本实验研究结果，若以血清PDGF值6 000 pg/mL作为鉴别诊断急性支原体肺炎、细菌性肺炎病毒性肺炎的基线值，则支原体感染患者阳性检出率为93.47%(43/46)。鉴于在7份急性细菌性肺炎和35份急性病毒性肺炎患者血清样品中分别有1份和2份样品PDGF值>6 000 pg/mL，故上述患者出现支原体感染的假阳性率为7.14% (3/42)。该项研究结果表明，血清PDGF值6 000 pg/mL对急性支原体与细菌/病毒感染具有很好的区分度。

若以血清BPI值80 ng/mL作为鉴别诊断急性细菌性肺炎与急性病毒性肺炎的基线值，则细菌感染患者阳性检出率为85.71%(6/7)。鉴于在31份急性病毒性肺炎血清样品中有1份血清样品BPI值>80 ng/mL，故上述患者出现细菌感染的假阳性率为3.22%(1/31)。该项研究结果表明，血清BPI值80 ng/mL对急性细菌和病毒感染具有很好的区分度。

在本实验中，急性支原体肺炎血清样品中有25份样品BPI值>80 ng/mL，17份样品BPI值<80 ng/mL；故血清BPI值80 ng/mL不能作为鉴别诊断急性细菌性肺炎与急性支原体肺炎的基线值。鉴于在本实验结果中，血清PDGF值检测结果，即支原体感染患者阳性检出率为93.47%，已将急性支原体肺炎与急性细菌性肺炎病毒性肺炎有效鉴别区分。因此，部分急性支原体肺炎患者血清BPI>80 ng/mL并不影响急性细菌性肺炎与急性支原体肺炎的鉴别诊断。

根据以上研究结果，拟制备的免疫胶体金检测试剂盒包括检测血清PDGF含量的测试纸卡I和检测血清BPI含量的测试纸卡II。结果判读标准：(1)测试纸卡I检测线处出现一条紫红色条带或测试纸卡I和II检测线处各出现一条紫红色条带，鉴定为急性支原体肺炎；(2)测试纸卡I检测线处无紫红色条带出现，测试纸卡II检测线处出现一条紫红色条带，鉴定为急性细菌性肺炎；(3)测试纸卡I和II检测线处均无紫红色条带出现，鉴定为急性病毒性肺炎。用测试纸卡I和II检测正常人血清也会出现上述结果，但正常健康人群无肺炎相关临床症状，也不会来医院就诊，因此不影响本试剂盒在临床上的使用。

本项研究获得的实验数据为免疫胶体金快速定性检测试剂盒的制备奠定了坚实的基础。鉴于研究对象，即急性肺炎患者病例数(88例)和不同病原体感染，特别是细菌性肺炎患者病例数(7例)较少，有可能影响PDGF/BPI鉴别诊断基线值的确定及相关病原体的阳性检出率和误诊率，因此需要进一步扩大病例数，以获得更为准确的PDGF/BPI鉴别诊断基线值及相关病原体的阳性检出率和误诊率。

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编辑慕萌

s， E-mail：anyunq@ccmu.edu.cn, caokin_ben@163.com

Studies of serum biomarkers to differentiate and diagnose acute pneumonia pathogens infection

Liu Meng1,2, Dou Yunpeng3, Gu Li1, Lyu Zhe3, Wang Yimin4, Liu Yingmei4, An Yunqing3*, Cao Bin2,4*

(1.DepartmentofInfectiousDiseasesandClinicalMicrobiology,BeijingChaoyangHospital,BeijingInstituteofRespiratoryMedicine,Beijing100020，China; 2.DepartmentofImmunology,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 3.DepartmentofImmunology,MicroecologyResearchCenter，CapitalMedicalUniversity,Beijing100069，China; 4.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029，China)

ObjectiveTo provide the experimental basis of a rapid immune colloidal gold test which used to differentiate and diagnose acute pneumonia patients infected with mycoplasma pneumoniae(MP)/virus/bacteria. MethodsThe level of platelet-derived growth factor (PDGF) and bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) in the serum of acute pneumonia patients with definite infection of mycoplasma pneumoniae /virus/bacteria and healthy controls were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. ResultsThere were 78 serum samples from healthy controls, 46 from acute MP patients, 42 from acute bacterial and viral pneumonia patients (7 from bacterial pneumonia and 35 from viral pneumonia patients). (2) PDGF values of healthy controls were all less than 6 000 pg/mL; BPI values were all less than 80 ng/mL. (3) If definition of the baseline value of PDGF which could diagnose acute MP infection is as 6 000 pg/mL, the positive detection rate of MP pneumonia patients was 93.47% (43/46), and the MP false positive rate of patients with viral or bacterial pneumonia was 7.14% (3/42). (4) If definition of the baseline value of BPI which could diagnose acute bacterial infection is 80ng/mL, the positive detection rate of patients with bacterial pneumonia was 85.71% (6/7), and the bacteria false positive rate of viral pneumonia patients was 3.22% (1/31). ConclusionUsing PDGF’s baseline value as 6 000 pg/mL and BPI’s 80 ng/mL to differential diagnosis has some clinical significance to differentiate acute MP/virus/bacterium infection.

pneumonia; differentiation diagnosis; platelet-derived growth factor; bactericidal/permeability-increasing protein

国家自然科学基金项目(81271840)，国家青年杰出基金项目(81425001)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81271840)， National Science for Distinguished Young Scholars(81425001).

时间：2016-10-1610∶55

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1055.004.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.016]

R 563.1

2016-09-05)