纤维剩余物发酵制备乙醇工艺研究

孟永斌 徐 蕾 张子东 路 祺 刘 英 聂思铭 祖元刚*

(1.东北林业大学生物资源生态利用国家地方联合工程实验室，哈尔滨 150040； 2.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

纤维剩余物发酵制备乙醇工艺研究

孟永斌1,2徐 蕾1,2张子东1,2路 祺1,2刘 英1,2聂思铭1,2祖元刚1,2*

(1.东北林业大学生物资源生态利用国家地方联合工程实验室，哈尔滨 150040；2.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

单因素实验和正交优化对固定化酵母制备工艺条件进行优化研究，并对固定化酵母的重复利用发酵能力进行了考察，其优化工艺条件为海藻酸钠与酵母质量比1∶2 g·g-1，底物糖浓度30%，酵母用量1.5 g，固定化酵母发酵120 h。在此条件下，乙醇产率均值为83.68%。为塔拉纤维剩余物的酶解液发酵制备乙醇提供技术支撑。

纤维剩余物;发酵;乙醇;固定化酵母

目前工业化制备没食子酸方法，虽然具有工艺成熟等优点，但也存在塔拉废渣对环境造成严重污染等问题[1～2]。塔拉经过碱提取没食子酸后，其废渣主要成分为综纤维素[3]。酵母是一种单细胞真菌，在有氧和无氧环境下都能生存，属于兼性厌氧菌[4]。发酵型的酵母无氧呼吸通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇来获取能量[5]。固定化酵母细胞技术[6～7]是20世纪60年代发展起来的生物技术，为近年来生物工程研究重点领域之一[8]。固定化酵母发酵将酵母细胞固定在不溶性物质上进行发酵过程，具有高效、专一、可回收利用及便于反应过程管理化、连续化及自控化等优点[9]。固定化的酵母发酵产生乙醇反应结束后可以回收，重复发酵使用，提高了酵母的利用率，降低发酵成本。本研究是通过单因素实验和正交优化对固定化酵母制备工艺条件进行优化研究，并对固定化酵母的重复利用发酵能力进行了考察，为塔拉纤维剩余物的酶解液发酵制备乙醇提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酵母，安琪酵母股份有限公司；乙醇(色谱级)；海藻酸钠、氯化钙、葡萄糖均为分析纯。塔拉纤维剩余物酶解糖液制备是通过前期正交实验得到纤维素酶水解塔拉纤维剩余物优化工艺条件，即料液比1∶6 g·mL-1，酶解温度55℃，pH6，酶解时间48 h。在此条件下，塔拉纤维剩余物酶解还原糖产率均值为43.95%。

7890A气相色谱仪，HP-55%苯甲基硅氧烷毛细管柱(0.25 μm×320 μm×30 m)以及G1540N-210FID(氢气火焰检测器)检测器；美国Agilent公司生产。

1.2 实验方法

本实验采用单因素实验设计探讨固定化酵母发酵各因素对乙醇产率的影响。在单因素实验基础上对固定化酵母发酵进行正交优化实验[10]。

1.2.1 气相色谱条件

柱箱子起始温度40℃维持5 min，然后以20℃·min-1的速度升温到200℃维持2 min。进样口和检测器温度分别设置为200℃和220℃。氮气作为载气流量为30 mL·min-1，分流比25∶1。氢气和空气流量分别为35和320 mL·min-1。尾吹流量25 mL·min-1[11～12]。

1.2.2 乙醇产率测定

将40 mL待测乙醇液体置于150 mL圆底烧瓶中，添加40 mL蒸馏水后进行蒸馏，采用50 mL容量瓶接收馏出液50 mL[13]。利用气相色谱测量乙醇PA利用乙醇标准曲线方程计算乙醇浓度CA。

(1)

1810年，Gay-Lussac建立了酵母菌发酵葡萄糖生产乙醇的反应式由式1可以看出，100 g的葡萄糖能够产生乙醇51 g，二氧化碳49 g；理论产量以重量计为51%。本章中定义乙醇产率是产生乙醇的量与理论产量的比值，根据公式2计算乙醇产率Y(%)。

(2)

式中：CA为样品蒸馏液乙醇浓度(mg·mL-1)；VA为样品蒸馏液体积(mL)；CG为样品葡萄糖溶液浓度(mg·mL-1)；VG为样品溶液体积(mL)。

1.2.3 酵母固定化

酵母活化：酿酒干酵母1.5 g，放入2%葡萄糖溶液30 mL中于35℃恒温条件下复水15 min，于35℃下恒温活化1 h后作酒母备用。

海藻酸钠—酵母悬液的制备：在30 mL蒸馏水中搅拌加热溶解0.338 g海藻酸钠，完全溶解后将温度降至30℃，均匀混合海藻酸钠溶液与活化酵母液，形成海藻酸钠—酵母悬液。

酵母细胞的固定化：在150 mL蒸馏水中搅拌溶解28.3 g的氯化钙，用5 mL注射器将海藻酸钠一酵母悬液缓慢滴入氯化钙溶液中进行造粒，混合后的菌悬液中的海藻酸钠在CaCl2溶液中与钙离子起到耦合作用，将海藻酸钠羧基上的钠换成钙，形成多维网格结构，生成凝胶和氯化钠；并将酵母固定在包埋剂中。固定化酵母凝胶珠在20℃下初步平衡1 h后，取出固定化酵母用蒸馏水洗去表面氯化钙溶液后，放入浓度为0.05 mol·L-1的氯化钙溶液中深度平衡24 h备用[13]。

2 结果与讨论

2.1 乙醇标准曲线

以乙醇浓度为横坐标，峰面积PA为纵坐标作图。线性回归方程y=525.61x+6.513，R2=0.999；乙醇标准曲线如图1。

图1 乙醇标准曲线Fig.1 Standard curve of alcohol

2.2 固定化酵母发酵制乙醇单因素实验

2.2.1 固定化酵母底物糖浓度对乙醇产率的影响

由图2可以看出底物糖浓度对固定化酵母发酵乙醇产率的影响。随着底物糖浓度的增加，溶液单位体积可利用的糖量也随之增加，固定化酵母发酵乙醇产率也随之缓慢增加；底物糖浓度达到30%时，固定化酵母发酵乙醇产率达到最大值。但过高底物糖浓度会造成酵母细胞失水，不利于酵母生存，失水后会对酵母的生命活动产生抑制。所以底物糖浓度达到50%，固定化酵母发酵乙醇产率迅速下降。通过单因素实验可知最适宜的底物糖浓度为30%。

2.2.2 固定化酵母用量对乙醇产率的影响

酵母用量对固定化酵母发酵乙醇产率的影响如图3。随着酵母用量的增加，固定化酵母发酵乙醇产率也随之大幅度增加；当酵母用量超过1.5 g时，由于溶液中酵母可利用的底物糖量是有限的，随着酵母用量继续增加固定化酵母发酵乙醇产率不再增加。因此，最适宜的酵母用量为1.5 g。

图2 固定化酵母底物糖浓度对乙醇产率的影响Fig.2 Effect of glucose concentration on immobilized yeast ethanol productivity

图3 固定化酵母用量对乙醇产率的影响Fig.3 Effect of mass on immobilized yeast ethanol productivity

2.2.3固定化酵母的海藻酸钠与酵母质量比对乙醇产率的影响

依据文献海藻酸钠溶液浓度选定为2.25%，海藻酸钠与酵母质量比对固定化酵母发酵乙醇产率的影响见图4。由图可知，随着海藻酸钠与酵母质量比的增加，即海藻酸钠用量逐渐增加时，固定化酵母凝胶珠数量逐渐增加，酵母与底物糖液接触面积逐渐增加，固定化酵母发酵乙醇产率随之增加[14]。当海藻酸钠与酵母质量比超过1∶2时，固定化酵母发酵乙醇产率呈现下降趋势，这是由于海藻酸钠用量继续增加时，固定化酵母凝胶珠虽然增多，但固定化酵母凝胶珠中酵母量降低幅度较大，不利于发酵，固定化酵母乙醇产率也随之降低。因此适宜的海藻酸钠与酵母质量比为1∶2，此条件下，固定化酵母发酵底物糖液制备乙醇产率为83.68%。

图4 固定化酵母的海藻酸钠与酵母质量比对乙醇产率的影响Fig.4 Effect of sodium alginate mass on immobilized yeast ethanol productivity

2.2.4固定化酵母发酵时间对发酵乙醇产率的影响

发酵时间对固定化酵母发酵乙醇产率的影响见图5。随着发酵时间延长，固定化酵母发酵乙醇产率呈现先逐渐增加后趋于平缓的趋势。随着固定化酵母发酵时间的延长，利用的底物糖量越来越少和乙醇产物的积累增加，导致固定化酵母发酵乙醇产率增加速率也逐渐缓慢；当固定化酵母发酵超过120 h，乙醇产率增加不明显。

图5 固定化酵母发酵时间对乙醇产率的影响Fig.5 Effect of time on immobilized yeast ethanol productivity

2.3 固定化酵母发酵制乙醇正交实验

通过前面单因素实验确定各因素取值范围，以乙醇产率为固定化酵母发酵反应性能评价指标，对海藻酸钠用量、底物糖浓度和酵母用量进行L9(3)4正交实验设计，探讨优化实验(表1～2)。

表1L9(3)4正交实验水平因素表

Table1OrthogonalexperimenttablelevelfactorsofL9(3)4

水平因素LevelfactorsA海藻酸钠与酵母质量比Theratioofsodiumalginate⁃yeast(g·g-1)B底物糖浓度Substratesugarconcentration(%)C酵母用量Yeastamount(g)11∶420121∶2301．531∶1．5403

表2L9(3)4正交实验结果

Table2OrthogonalarraydesignL9(3)4andexperimentalresults

因素FactorABC实验结果Results111176．37212279．73313374．90421282．59522381．16623179．18731377．69832180．59933278．49K177．0078．8878．71K280．9780．4980．27K378．9277．5277．92R3．9772．9702．353最优条件A2B2C2

直观分析表2正交实验的结果，根据均值(K)，可知最优实验条件为A2B2C2。，海藻酸钠与酵母质量比1∶2 g·g-1，底物糖浓度30%，酵母用量1.5 g为实验最优条件。从各因素极差值(R)可知，A>B>C；对固定化酵母发酵制乙醇的主次顺序为：海藻酸钠用量>底物糖浓度>酵母用量。

固定化酵母发酵制乙醇产率的方差分析数据见表3。查表有F0.01(2,2)=99；F0.05(2,2)=19；F0.1(2,2)=9。当F>F0.01，有高度显著影响；当F0.01>F>F0.05，有显著影响；当F0.05>F>F0.1时，有一定的影响；当F

计算结果表明，因素A的FA，为F0.01>FA>F0.05；因素B的FB，为F0.05>FB>F0.1；因素C的FC，为F0.05>FC>F0.1；因此，因素A对固定化酵母发酵制乙醇产率的影响显著，因素B和因素C对固定化酵母发酵制乙醇产率有一定的影响。

表3 方差分析

通过正交实验得到固定化酵母发酵葡萄糖液制乙醇的优化工艺条件：海藻酸钠与酵母质量比1∶2 g·g-1，底物糖浓度30%，酵母用量1.5 g；三次固定化酵母发酵制乙醇重复实验的结果为84.73%，83.54%，82.77%，均值为83.68%，表明基本稳定，重复性较好。

图6 固定化酵母重复次数对乙醇产率的影响Fig.6 Effect of times of repetition on immobilized yeast ethanol productivity

2.4 固定化酵母重复发酵能力

由图6可知，随着固定化酵母重复利用次数的增加，乙醇转化率逐渐降低，其中第四次发酵液乙醇产率为54.94%，在第四次循环发酵结束后，固定化酵母表面开始出现细裂纹。第六次发酵液底物糖转化率为38.63%。固定化酵母重复发酵实验结果表明，固定化酵母发酵能力随发酵次数的增加逐渐下降，循环利用发酵四次后，固定化酵母包埋能力和发酵性能下降较大，这主要是由于酒精发酵过程中，乙醇浓度逐渐增大，产生反馈抑制，而且浓度越大，抑制作用越强。乙醇不仅可以抑制糖代谢和转运途径，还可抑制细胞膜上ATP酶活性，最终削弱细胞膜对酵母细胞的保护作用。另外，乙醇还可引起细胞内线粒体的氧化损伤。随着循环利用次数的增加，乙醇对酵母细胞抑制作用时间就越长，从而对酵母细胞造成不可逆的破坏，使部分菌体丧失了发酵能力，发酵性能逐渐下降[15]。

3 结论

通过单因素实验确定固定化酵母发酵制乙醇工艺各个因素取值范围，并通过正交实验得到优化工艺条件：海藻酸钠与酵母质量比1∶2 g·g-1，底物糖浓度30%，酵母用量1.5 g。固定化酵母发酵120 h乙醇产率均值为83.68%，表明实验结果基本稳定，重复性较好。葡萄糖溶液最优条件下固定化酵母发酵可重复使用四次，第四次乙醇产率为54.94%；为下一步塔拉纤维剩余物酶解糖液发酵制备乙醇提供了理论基础。

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EthanolProductionTechnologybyFermentationformFiberResidues

MENG Yong-Bin1,2XU Lei1,2ZHANG Zhi-Dong1,2LU Qi1,2LIU Ying1,2NIE Si-Ming1,2ZU Yuan-Gang1,2*

(1.National Local Joint Engineering Laboratory for Ecological utilization of biological resources,Harbin 150040；2.Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Northeast Forestry University,Ministry of Education,Harbin 150040)

We studied the effects of various factors on the yield of ethanol from enzymatic hydrolysate of Tara fiber residues by the single factor experiment, and then optimized ethanol production technology by orthogonal experiments. The optimum conditions were the ratio of sodium alginate-yeast of 1∶2 g·g-1, substrate sugar concentration of 30%, the amount of yeast of 1.5 g, and fermentation time of 120 h, with the yield of ethanol of 83.68%.

fiber residues;fermentation;ethanol;immobilized yeast

黑龙江省博士后资助项目(LBH-Z14015)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572014EA01-03)

孟永斌(1990—)，男，硕士研究生，主要从事生物质资源化利用研究。

* 通信作者：E-mail:zuyuangangnefu@126.com

2015-09-11

Q539.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.023