合欢硬枝扦插生根解剖及相关酶活性变化研究

周祥明 刘玉堂 赵宪争 宋兆伟 王 姝

(天津市农业生物技术研究中心，天津 300384)

合欢硬枝扦插生根解剖及相关酶活性变化研究

周祥明 刘玉堂 赵宪争 宋兆伟 王 姝

(天津市农业生物技术研究中心，天津 300384)

以合欢1年生硬枝为试材，通过石蜡切片法对合欢插穗不定根发生进行解剖学研究，同时，利用比色法对扦插后不同时间的材料进行了过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)测定。结果表明：合欢属于诱导型生根，观察到其不定根原基起源于形成层；在整个生根过程中，处理组和对照组的POD、PPO和IAAO酶活变化趋势基本一致，但3种酶活均高于对照。

合欢；扦插；不定根；解剖；酶活性

合欢(AlbiziajulibrissinDuraxx.)又称绒毛树、马樱花等，属豆科(Leguminosae)合欢属(Albizia)植物，具极高的观赏和经济价值，且还具有美好的象征寓意，因而深受喜爱[1～2]。目前，合欢主要通过种子繁殖，既有性繁殖，而有性繁殖存在变异大，不能保持合欢原有优良性状。实践证明，扦插是林木进行无性繁殖最简单、经济手段。因此，探索合欢扦插繁殖技术具有实际意义，可为合欢优良基因资源的保存和开发利用开辟新的途径，也为其它林木扦插研究奠定基础。

目前，合欢扦插研究报道仅见朱效增等人[3]研究，而较为全面系统研究合欢扦插生根未见报道。笔者经过多年研究发现，合欢扦插生根属于极难生根类型。经过多年的研究，建立了一套促进合欢扦插生根的技术体系，并在此基础上，对扦插生根过程中3种相关氧化酶(POD、PPO、IAAO)活性进行检测与分析；同时，进行了不定根发生和发育的形态解剖学研究，初步揭示了合欢扦插的生根机理。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为1年生合欢(A.julibrissin)硬枝，于2014年10月27日采自天津静海陈官屯试验地。生根诱促剂为自配试剂。

1.2 材料采集及处理

10月底剪取1年生生长旺盛、无病虫害的木质化枝条做插穗，插穗规格长度为10～12 cm左右，保留4～5个腋芽，上切口在芽上方1 cm处平切，下切口在芽下方0.5 cm处平切，确保切口光滑，不保留叶片。

将采集剪取好的插穗以20根一捆，用自配生根诱促剂24 h浸泡插穗基部3 cm处，将浸泡后的插穗垂直插入盛有蛭石的营养钵中，深度约为插穗长度的1/2。清水处理作为对照。于10月28日将扦插后的材料置于实验室内，并覆膜以保持湿度。

1.3 研究方法

1.3.1 扦插生根过程中相关酶活性测定

自扦插当日起至60 d，每隔10 d取样，进行POD、PPO和IAAO活性测定。其中，POD活性测定采用愈创木酚比色法；PPO活性测定采用邻苯二酚比色法；IAAO采用二氯酚比色法。3种酶活测定均参照汤绍虎等编资料[4]。

1.3.2 试验数据处理

试验数据采用Excel软件进行处理分析。

1.3.3 扦插生根的形态解剖观察

扦插当日随机选取5个插穗，剪取插穗形态学下部1 cm小段，以后每隔10 d取材1次。FAA固定，酒精(95%)-甘油混合液(1∶1)软化，采用常规石蜡切片法制片，切片厚度为10 μm，番红-固绿对染法染色，Nikon显微镜观察拍照。

2 结果与分析

2.1 扦插生根过程中3种氧化酶活性变化分析

2.1.1 过氧化物酶(POD)活性变化

POD普遍存在于植物体内，其可氧化体内IAA。据研究报道，IAA的存在影响着植物不定根的起源和生长，Gaspar等[5]将其作为生根标志之一。本研究发现，在合欢扦插生根过程中，对照和处理POD活性变化趋势基本相似，但处理组POD活性高于对照(图1)。在插后的前20 d，POD活性均上升，即为不定根诱导期，POD活性上升氧化体内过多的内源IAA，促进诱导根原基；随后POD活性开始下降(20～40 d)，导致内源IAA含量上升，有利于不定根的表达；接着POD活性又开始上升(40～60 d)，即为不定根生长期，POD活性开始升高，促进不定根伸长。

图1 扦插生根过程中POD活性变化Fig.1 POD activity during adventitious root formation

2.1.2 多酚氧化酶(PPO)活性变化

PPO催化酚类物质与IAA复合形成一种“IAA-酚酸复合物”，该复合物是一种生根辅助因子，具有促进不定根形成的活性。

图2中可知，合欢扦插生根过程中，处理组和对照组PPO活性呈现“升高—降低—升高”的趋势，但处理组PPO活性高于对照组。处理穗条在扦插后20 d根原基诱导期，PPO活性升高；随后逐渐下降，此时为不定根伸长生长期。在整个生根过程中，处理组PPO活性均高于对照组。

图2 扦插生根过程中PPO活性变化Fig.2 PPO activity during adventitious root formation

2.1.3 吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性变化

合欢扦插过程中，处理组和对照组IAAO活性变化趋势基本一致。在扦插后的10 d内，IAAO活性略微下降；在扦插10～20 d内，处理组IAAO活性迅速上升，而对照组则上升缓慢。在整个生根过程中，对照组IAAO活性低于处理组(图3)。

IAA含量变化影响不定根的发生。在扦插前期，IAAO活性相对较低，有利于不定根原基发生[6]。在不定根诱导期，IAAO活性上升，降低了内源IAA水平，符合低浓度IAA有利于生根的观点[7]。有研究报道，在不定根表达期，较高浓度的IAA促进不定根生长，IAAO活性表现较低[8]，也有认为在不定根表达期IAAO活性较高，降低体内IAA含量，促进不定根伸长[9]。

2.2 合欢扦插生根外部形态

通过对合欢硬枝扦插过程中形态学基部观察发现，扦插后10 d，处理组与对照组插穗基部无明显变化(图4:a)，扦插后30 d观察，处理组插穗部分在下切口处开始有突起，部分插穗皮孔膨大，且在皮孔处产生白色絮状物质(图4:b)；对照组下切口处无突起现象，但部分插穗在皮孔处产生白色絮状物质。扦插后40～60 d，处理组插穗出现白色不定根(图4:c～d)；对照组则无变化，也无生根现象(图4:e)。

图3 扦插生根过程中IAAO活性变化Fig.3 IAAO activity during adventitious root formation

图4 合欢扦插生根过程形态特征Fig.4 Morphological features of the rooting process of cutting for A.julibrissin

图5 合欢插穗不定根发生过程 a.茎段横切面；b.根原基形成；c.不定根伸出皮孔 Ar.不定根；Co.皮层；Ph.韧皮部；Pi.髓；Rp.根原基；Xy.木质部Fig.5 Origin of adventitious roots of cutting for A.julibrissin a.Transverse section of stem；b.Root primordium formation；c.Emergence of adventitious roots from lenticels Ar.Adventitious roots；Co.Cortex；Ph.Phloem；Pi.Pith；Rp.Root primordium；Xy.Xylem

2.3 插穗茎扦插前解剖构造

合欢插穗横切面由外及内分别为表皮、皮层、韧皮部、木质部、髓。大量切片观察表明，合欢插穗茎段形态学基部未存在潜伏根原基(图5:a)。

2.4 不定根发生发育

经过处理的合欢插穗在扦插20 d后镜检结果显示，髓射线正对形成层细胞分裂旺盛，并不断进行平周和垂周分裂，形成一球形细胞团，这团细胞群就是根原基原始细胞。根原始细胞不断分裂并突破皮层，最终发育成不定根(图5:b～c)。

3 讨论

合欢插穗生根与POD、PPO及IAAO 3种酶活性密切相关。自配生根诱促剂提高了这3种酶活性，且呈现一定规律。在整个生根期间，处理组与对照组的3种酶活性变化趋势基本一致，但处理组酶活均高于对照组，说明这3种酶活性的提高促进了合欢插穗生根。POD活性提高一方面是由植物生长调节剂刺激，另一方面可能是由于离体原因促使呼吸增加而造成，在合欢生根过程中，POD可能参与了木质素的合成，如细胞壁的形成和根的木质化需要木质素。PPO活性升高，可能导致生根促进因子"IAA-酚酸复合物"相应增多，促进了不定根形成。IAAO活性在插穗不定根诱导和发生期升高，促使内源IAA水平降低，符合低浓度IAA诱导根原基形成观点[8]。

插穗生根与否是扦插的关键因素[10]。根原基分为潜伏根原基和诱导根原基。潜伏根原基在插穗发育早期产生，但处于休眠状态，一旦插穗离休后在适宜的条件下发育成不定根；而诱导根原基是在扦插过程中通过诱导而形成的根原基，而在扦插前不存在根原基。通过切片观察合欢茎段，未发现潜伏根原基，故合欢插穗不定根属于诱导根原基。另外，不定根原基只在形成层与髓射线交叉处发生，而未在形成层、皮层薄壁细胞、韧皮部等其它部位发生，因此，合欢插穗不定根属于单位点发生。

1.周祥明,郝志愚,夏时云,等.根癌农杆菌介导合欢转TaNHX2基因体系的优化[J].植物研究,2013,33(2):197-201.

2.侯修胜,孟凡锋,张希明,等.合欢栽培技术及园林应用[J].山东林业科技,2005,4:55.

3.朱效增,焦传礼,谢丽静,等.合欢硬枝扦插育苗技术[J].山东林业科技, 2001(增刊):158.

4.汤绍虎,罗充.植物生理学实验教程[M].重庆:西南师范大学出版社,2012:126-129,159-160.

5.Gaspar T,Kevers C,Hausman J F,et al.Practical uses of peroxidase activity as a predictive marker of rooting performance of micropropagated shoot[J].Agronomie,1992(12):757-765.

6.Wiesmann Z,Riov J,Epstein E.Comparison of movement and metabolism of indole-3-acetic and indole-3-butyric acid in mung bean cuttings[J].Physiol Plant,1988,74:556-560.

7.宋金耀,何文林,李松波,等.毛白杨嵌合体扦插生根相关理化特性分析[J].林业科学,2001,37(5):64-67.

8.Pacheco P,Calderon B X,Vega A.Flavonoids as regulators and markers of root formation by shoots ofEucalyptusglobulusraised invitro[J].Plant Perox Newslett,1995,5:9-12.

9.Nag S,Saha K,Choudhuri M A.Role of auxin and polyamines in adventitious root formation in relation to changes in compounds involved in rooting[J].Plant Growth Regul,2001,20:182-194.

10.姚景瀚,李伟.沙棘微扦插不定根发生的形态解剖学研究[J].北京林业大学学报,2013,35(2):130-133

RootingAnatomyofHardwoodCuttingforAlbiziajulibrissinDuraxx.andActivityChangeofRelatedEnzymesDuringRootingProcess

ZHOU Xiang-Ming LIU Yu-Tang ZHAO Xian-Zheng SONG Zhao-Wei WANG Shu

(Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology,Tianjin 300384)

With one-year hardwood cutting fromAlbiziajulibrissinDuraxx. trees, we studied the anatomical structure during the formation of adventitious roots by paraffin section, and detected the activities of peroxidase(POD), polyphenol oxidase(PPO) and indoleaceticacid oxidase by colorimetry. The adventitious root ofA.julibrissincuttings was derived from a type of induced root primordium, and the primordium of adventitious root originated from the cambium. The enzyme activities of POD, PPO and IAAO showed the same trends in treatment and control during rooting process, but the activities of three enzymes in treatment were higher than those in control.

Albiziajulibrissin；Cutting；adventitious root；anatomy；enzymatic activity

天津市科技支撑计划(12ZCDZNC04700)

周祥明(1975—)，男，博士，主要从事植物分子育种研究。

2015-08-10

Q949.751.9

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.008