不同佐剂制备的鸡坦布苏病毒灭活疫苗免疫效果比较

刘宇卓，李嘉萍，李 银，黄欣梅，赵冬敏，韩凯凯，杨 婧，刘青涛，毕可然

(江苏省农业科学院 兽医研究所/农业部 动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京210014)



不同佐剂制备的鸡坦布苏病毒灭活疫苗免疫效果比较

刘宇卓，李嘉萍，李 银，黄欣梅，赵冬敏，韩凯凯，杨 婧，刘青涛，毕可然

(江苏省农业科学院 兽医研究所/农业部 动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京210014)

以不同材料为佐剂制备坦布苏病毒灭活疫苗，用ELISA方法检测免疫鸡不同时间抗体产生的情况，以选择最佳制苗佐剂。取40只1月龄SPF鸡，随机分成8组，以不同的佐剂组合制备疫苗，免疫7个组(包括白油组、白油+IL-2组、铝胶组、铝胶+IL-2组、蜂胶组、蜂胶+IL-2组、IL-2组)，另设不免疫对照1个组，分别于免疫前及免疫后1周、2周、3周和4周采血，用已建立的ELISA方法检测血清中的ELISA抗体，比较不同佐剂灭活疫苗的免疫效果。结果表明：以白油+IL-2作为佐剂组的灭活疫苗效果最好，产生的抗体水平优于其他各组，免疫后3周ELISA抗体可达到1∶800以上，是较理想的制备坦布苏病毒灭活疫苗的佐剂。

佐剂；坦布苏病毒；灭活疫苗；免疫效果

2010年4月，我国多地相继暴发了一种由黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)的坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)感染种鸭、种鹅、蛋鸭、蛋鹅的事件，其是以产蛋骤然大幅下降，甚至停产为主要临床特征，并伴有食欲急剧减退、高热、运动障碍，排绿色粪便的急性传染病[1-4]。肉鸭、肉鹅均可感染，之后陆续有研究报道，鸡也可感染此病毒而发病，临床症状及表现与鸭、鹅相似[5-8]。目前学者在 TMUV 研究领域取得了重要进展，国内外研究者针对病毒分离、鉴定及生物学特性做了大量研究工作[9-12]。已有研究证明鸭坦布苏病毒能够有效诱导抗体和细胞免疫反应，也有针对鸭的疫苗在研发中，但针对鸡的TMUV灭活疫苗研发及其佐剂方面的研究较少。

疫苗佐剂是能够非特异性地改变或增强机体对抗原特异性免疫应答、发挥辅助作用的一类物质。本研究通过比较白油、铝胶、蜂胶、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)作为佐剂单独使用及联合使用后，对TMUV灭活疫苗免疫鸡后产生抗体的影响，以期能筛选出免疫效果佳、用于鸡的坦布苏病毒灭活疫苗的佐剂。

1　材料与方法

1.1病毒株

坦布苏JS804株，由江苏省农业科学院兽医所禽病实验室分离、鉴定、保存。

1.2实验动物

本研究室饲养1月龄SPF鸡。

1.3主要试剂

白油、铝胶均由本研究室保存；IL-2由南京农业大学动物医学院寄生虫实验组提供；蜂胶购自老山药业股份有限公司；酶标二抗为HRP标记的兔抗鸡IgY，购自美国EARTH公司；BSA、TMBS均购自BIOSHARP公司。鸡坦布苏病毒ELISA抗体检测试剂盒，由本研究室制备并保存。

1.4主要仪器

立式压力蒸汽灭菌器(SY-450)购自徐州圣业医疗器械有限责任公司；精密电子天平(AA200)购自美国丹佛仪器公司(Denver Instrument)；二级生物安全柜购自西班牙Telsta BioIIA公司；优普超纯水制造系统购自南京优普实验仪器有限公司；高速冷冻离心机购自德国艾本德公司(Eppendorf)；低温冰箱购自海尔公司；电热恒温培养箱(DNP-9162A)购自上海光都仪器设备有限公司；酶标仪(ELx800)购自美国伯腾仪器有限公司(Biotek)。

1.5抗原制备

取TMUV细胞毒，向200 mL TMUV细胞毒中加入0.6 mL的甲醛，充分混匀，37 ℃灭活24 h。

1.6不同佐剂灭活疫苗的制备

1.6.1白油佐剂取47 mL白油与3 mL司本-80混合，高温灭菌，即为油相；取灭活后的TMUV 25 mL，加入1.5 mL吐温-80混匀，即为水相；将油相用乳化仪低速搅拌，加入水相，高速搅拌1 min，即制成1号苗。

1.6.2白油+IL-2佐剂取灭活后的TMUV 5 mL，加入1 mL浓度为4 mg/mL的IL-2、 0.3 mL吐温-80，混匀，即为水相；将油相用乳化仪低速搅拌，加入水相，搅拌1 min，即制成2号苗。

1.6.3铝胶佐剂取7.5 g铝胶，加入50 mL PBS，充分溶解，用乳化仪低速搅拌，溶解后的铝胶与灭活后的TMUV以2∶1的体积比混合，搅拌1 min，即制成3号苗。

1.6.4铝胶+IL-2佐剂取10 mL溶解后的铝胶溶液，用乳化仪低速搅拌，加入灭活后的TMUV 5 mL和1 mL IL-2,搅拌1 min，即制成4号苗。

1.6.5蜂胶佐剂取3 g蜂胶，加入50 mL 95%酒精，37 ℃、溶解24 h，取5 mL溶解后的蜂胶溶液，用乳化仪低速搅拌，加入灭活后的TMUV 5 mL，搅拌1 min，即制成5号苗。

1.6.6蜂胶+IL-2佐剂取5 mL溶解后的蜂胶溶液，用乳化仪低速搅拌，加入灭活后的TMUV 5 mL和1 mL IL-2，搅拌1 min，即制成6号苗。

1.6.7IL-2佐剂灭活后的TMUV和IL-2充分混匀, 用乳化仪搅拌1 min，即制成7号苗。

1.7疫苗的免疫接种

取1月龄SPF鸡40羽，随机分成8组，每组5只，第1～7组按表1腿部肌肉注射不同佐剂的灭活疫苗，第8组不接种作为空白对照。

表1　动物分组及免疫情况

1.8免疫效果的检测

1.8.1采血检测分别于免疫前及免疫后1、2、3、4周在鸡翅下静脉采血，37 ℃放置1 h，于4 ℃过夜后，经3000 r/min离心5 min，分离血清，取上清液，置-20 ℃保存。

1.8.2血清抗体的检测利用本研究室制备的ELISA试剂盒进行检测。

1.8.3判定方法如果 P/N [(样品孔OD450nm-空白孔OD450nm)/(阴性孔OD450nm-空白孔OD450nm)]≥2.1 ，则判为阳性，否则判定为阴性。

2　结果与分析

2.1免疫前抗体测定

抗体检测结果均为阴性。

2.2白油及白油+IL-2佐剂组免疫后不同时间的抗体

接种白油佐剂灭活疫苗，结果见表2。免疫后第1周只有20%(1/5)检测到抗体，第2周100%抗体效价可达1∶100以上，到第4周，抗体效价在1∶400以上，且最高抗体效价为1∶800。

表2　白油佐剂组各鸡的抗体效价

同时免疫了白油+IL-2佐剂组灭活疫苗的抗体结果见表3。相对于单独免疫白油佐剂组疫苗的抗体，总体水平抗体产生早，且抗体水平均较高，当免疫至第4周时，平均抗体达到720。

表3　白油+IL-2佐剂组各鸡的抗体效价

2.3铝胶及铝胶+IL-2佐剂组免疫后不同时间的抗体

由测得抗体可知，两组免疫效果均不佳，免疫后第3周抗体均值达到1∶120，且个别个体检测不到抗体，至第4周平均抗体才达到250，说明抗体上升缓慢。而同时接种了铝胶+IL-2的佐剂组，抗体水平明显高于单独接种铝胶组，至免疫后第4周，平均抗体达到320。详细结果见表4、表5。

表4　铝胶佐剂组各鸡的抗体效价

表5　铝胶+IL-2佐剂组各鸡的抗体效价

2.4蜂胶及蜂胶+IL-2佐剂组免疫后不同时间的抗体

接种蜂胶灭活疫苗组，免疫后第1周，即有40%的抗体效价达到1:100，第2周和第3周抗体水平略有上升，至第4周时，抗体有升有降，平均抗体与第3周相同。接种蜂胶+IL-2灭活疫苗组，相应的抗体水平也均较单独免疫蜂胶佐剂的高，结果见表6、表7。

2.5IL-2佐剂免疫组免疫后不同时间的抗体

接种IL-2灭活疫苗组，免疫后第1周抗体水平就有明显升高，第2、第3周，抗体水平持续升高，第4周时，抗体水平呈现下降趋势。结果见表8。

表6　蜂胶佐剂组各鸡的抗体效价

表7　蜂胶+IL-2佐剂组各鸡的抗体效价

表8　IL-2佐剂组各鸡的抗体效价

2.6免疫后不同佐剂组抗体平均水平比较

不同组别免疫后抗体平均水平见图1。从图1中可以看出，白油佐剂组抗体明显高于铝胶组及蜂胶组。在每个小组里，加入IL-2的比同期未加组抗体滴度高。

图1　不同组别的抗体效价

3　讨论

佐剂是动物疫苗中的重要组成部分，是一种非特异性免疫增强剂，能够提高抗原对机体的免疫原性，增强疫苗免疫效果，被广泛应用于疫苗研究与生产。选择合适的佐剂，对于提高疫苗免疫效果和减少不良反应有着重要的意义。而细胞因子调节固有免疫和适应性免疫应答，可作为佐剂增强疫苗免疫的效应[13-17]。

白细胞介素是一种糖蛋白，在机体的免疫应答及免疫调节过程中有着重要作用。研究证明：鸡IL-2能显著提高疫苗的免疫应答，IL-2作灭活疫苗的免疫增强剂，能使灭活苗的高水平抗体效价维持时间较长，且0.06～0.10 mg的鸡IL-2蛋白作为佐剂较合适[16]。本实验结果显示灭活疫苗中具有IL-2佐剂成分的实验组抗体水平均高于相同条件实验组。

白油佐剂乳化后在注射部位的贮库效应能延长抗原在体内的存留时间，缓慢释放抗原，不断刺激机体，提高抗原的免疫原性刺激，且在注射部位引起细胞浸润，促使抗原呈递细胞、巨噬细胞、淋巴细胞增殖从而提高免疫应答水平。其次乳剂能够包裹抗原，保护其不被体液中的酶迅速分解，延长抗原刺激机体的时间；此外油乳佐剂还能刺激各种细胞因子的分泌，促进抗体产生。从本实验结果来看，白油佐剂效果最好，配合IL-2使用，免疫效果更佳。

铝胶佐剂使抗原滞留，缓慢释放，并可引起局部炎症反应，从而吸引活性淋巴细胞，增强免疫应答，还可激活补体系统，起抗原储存库和传递作用。铝胶佐剂灭活苗以凝胶状态注入动物体内后，不溶性颗粒能吸附、分散抗原物质，增加抗原表面积，在组织中形成一个富含巨噬细胞的肉芽肿，延缓吸收。铝胶佐剂存在的主要问题是激活Th2型免疫细胞，只诱导体液免疫应答，且在注射部位缓慢释放抗原的效应较低，但应激较小。本实验结果表明，作为坦布苏病毒灭活疫苗佐剂免疫鸡，铝胶佐剂的免疫效果并不理想，配合IL-2使用虽然能提高免疫后抗体的滴度，但效果也不佳。

蜂胶是工蜂从树芽、树皮或其他植物幼芽上采集来树脂，并混入它的上颚腺分泌物和蜂蜡等加工而成，是一种粘性、胶状、含有树脂的物质。其中含树脂类化合物、多酚类化合物、多糖类化合物，细菌脂多糖对体液免疫和细胞免疫都有辅助作用，可引起动物特异性应答，还可调节巨噬细胞表面Ia分子的表达，从而改变抗原的递呈。用蜂胶佐剂疫苗免疫动物，机体能更快速、更高效、更持久产生抗体，能全面启动机体的免疫防卫系统，刺激机体细胞免疫、体液免疫、红细胞免疫系统和巨噬细胞补体系统产生免疫应答。本实验中蜂胶佐剂疫苗的免疫效果未见特别突出，可能由于蜂胶较难溶解，导致灭活疫苗中蜂胶的含量不够，影响了免疫效果。

从实验结果可知，白油+IL-2作为佐剂制成TMUV灭活疫苗免疫SPF鸡效果最好，不但抗体产生快、抗体滴度高，且高滴度抗体持续时间也长，明显优于其他各组，为制备本疫苗的首选佐剂。

[1] 刘友生,彭春香,傅光华,等.2010～2011年中国部分地区禽坦布苏病毒感染调查及分子变异分析[J].中国动物传染病学报,2012,20(1):47-53.

[2] 李宁,相海苓,刘立涛,等.鸭坦布苏病毒病研究进展[J].水禽世界,2013(2):41-45.

[3] 朱丽萍,颜世敢.鸭坦布苏病毒研究进展[J].中国预防兽医学报,2012,34(1):79-82.

[4] 吕桂霞,裴苹苹.坦布苏病毒的最新研究进展[J].山东畜牧兽医,2013,34(5):79-80.

[5] 傅光华,黄瑜,施少华,等.鸡黄病毒的分离与初步鉴定[J].福建畜牧兽医,2011,33(3):1-2.

[6] 陈仕龙,陈少莺,王劭,等.一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒的分离与初步鉴定[J].福建农业学报,2011,26(2):170-174.

[7] 刘宇卓,宋子梁,李银,等.6日龄雏鸡混合感染坦布苏病毒和多杀性巴氏杆菌的病原学研究[J].江西农业学报,2015,27(4):81-84.

[8] Tang Y, Diao Y, Gao X, et al. Analysis of the complete genome of Tembusu virus, a flavivirus isolated from ducks in China [J]. Transbound Emerg Dis, 2012, 59(4): 336-343.

[9] 黄欣梅,赵冬敏,刘宇卓,等.禽黄病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用[J].畜牧与兽医,2012,44(6):5-8.

[10] 李庆阳,陈芳艳,刘平鸭,等.鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2012,33(7):18-22.

[11] 韩凯凯,李银,黄欣梅,等.鹅源坦布苏病毒RT_LAMP快速检测方法的建立[J].浙江农业学报,2014,26(1):29-33.

[12] 谢星星,李祥瑞,李银,等.检测坦布苏病毒病抗体NS1_ELISA方法的建立与初步应用[J].浙江农业学报,2014,26(1):135-140.

[13] 杨楷,潘贵珍,胡庭俊,等.复方天门冬多糖注射液对猪伪狂犬病疫苗免疫效果的影响[J].南方农业学报,2014,45(11):2081-2086.

[14] 李娜,周伟芳,刘慧敏,等.疫苗佐剂的研究现状和发展趋势[J].中国预防兽医学报,2013,35(1):81-86.

[15] 周洋,耿兴超,汪巨峰,等.疫苗佐剂最新研究进展[J].中国新药杂志,2013,22(1):34-42.

[16] 徐前明,李祥瑞.重组鸡IL-2对禽流感灭活苗免疫增强作用试验[J].动物医学进展,2006,27(10):99-101.

[17] 谭伟,谢丽基,谢芝勋.禽流感病毒疫苗研究进展[J].南方农业学报,2014,45(8):1492-1497.

(责任编辑：许晶晶)

Comparison of Immune Effect of Chicken Tembusu Virus Inactivated Vaccine with Different Adjuvants

LIU Yu-zhuo, LI Jia-ping, LI Yin, HUANG Xin-mei, ZHAO Dong-min,HAN Kai-kai, YANG Jing, LIU Qing-tao, BI Ke-ran

(Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology, Ministry of Agriculture / National Research Center for Engineering and Technology of Veterinary Bio-products, Nanjing 210014, China)

Tembusu virus inactivated vaccines were mixed with different adjuvants (oil, oil+IL-2, alumina gel, alumina gel+IL-2, propolis, propolis+IL-2, and IL-2). Forty 1-month-old SPF chickens were randomly divided into 8 groups, seven groups were immunized with different Tembusu virus inactivated vaccines respectively, and one group was not immunized for blank control. The serum samples of immunized chickens were collected before immunization, as well as 1 week, 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks after immunization respectively. The antibody levels of various serum samples were detected by using ELISA method, in order to compare the immune effects of Tembusu virus inactivated vaccine with different adjuvants. The results showed that the Tembusu virus inactivated vaccine mixed with oil+IL-2 had the best immune effect, and the ELISA antibody titer could reach 1∶800 3 weeks after immunization. Therefore, oil and IL-2 were the ideal adjuvants for the preparation of Tembusu virus inactivated vaccine.

Adjuvant; Tembusu virus; Inactivated vaccine; Immune effect

2016-05-24

刘宇卓(1967─)，女，黑龙江泰康人，研究员，硕士，主要从事家禽疫病诊断、禽用生物制品研发。

S852

A

1001-8581(2016)10-0060-04