基于线粒体DNA细胞色素b基因部分序列的新疆裸重唇鱼遗传多样性分析

郭飏，胡文革，莫超，武菲，王翠华，马得草，何园

（石河子大学生命科学学院，新疆石河子832000）

基于线粒体DNA细胞色素b基因部分序列的新疆裸重唇鱼遗传多样性分析

郭飏，胡文革，莫超，武菲，王翠华，马得草，何园

（石河子大学生命科学学院，新疆石河子832000）

为对新疆不同水系（开都河、玛纳斯河、喀什河、巩乃斯河）4个野生新疆裸重唇鱼Gymnodiptychus dybowskii群体的遗传多样性与种群遗传结构进行研究，提取了新疆裸重唇鱼线粒体DNA Cytb基因的部分序列，并利用生物学软件对获取的基因进行分析。结果表明：在74个样品中共检测到9个单倍型，变异位点15个，在开都河（21尾）、巩乃斯河（27尾）、喀什河（2尾）、玛纳斯河（24尾）的样品中，分别检测到1、11、5、1个变异位点；新疆裸重唇鱼群体平均单倍型多样性（Hd）和平均核苷酸多样性（Pi）分别为0.810和0.005 9；群体间遗传分化系数（FST）分析显示，玛纳斯河群体与其他3个群体间存在较大的分化（FST＞0.15），而其他群体间分化程度较低（0.05＜FST＜0.15）；基因流Nm值显示，巩乃斯河群体与喀什河群体间存在极大的基因交流；分子系统树和单倍型网络图分析表明，新疆喀什河群体与其他群体间单倍型关系较远，而其他群体间单倍型关系较近。研究表明，新疆裸重唇鱼4个群体鱼类种质资源均遭受极大破坏，应加强渔业管理措施，设立专门的机构，保护新疆裸重唇鱼及其他土著鱼类资源。

新疆裸重唇鱼；线粒体DNA细胞色素b；遗传多样性

遗传多样性作为生物多样性最重要的部分，它与物种的濒危、灭绝有直接关系，较高水平的遗传多样性可以维持群落、生态系统的稳定，故从群体的遗传变异及其遗传多样性水平探讨物种的种质资源现状具有重要的意义。

新疆地区具有独特的水系分布，这种特殊性造就了新疆特有土著鱼类多达50余种，到目前为止，虽然这些鱼类资源绝大多数还未得到有效开发，但其生存状况堪忧，如扁吻鱼（俗称新疆大头鱼）这种世界范围内裂腹鱼亚科的珍贵物种，被誉为古鱼类活化石，属于一级保护动物，有着极高的研究价值。新疆裸重唇鱼Gymnodiptychus dybowskii与新疆大头鱼生境相同，同属裂腹鱼亚科，作为新疆土著鱼类也急需保护。新疆裸重唇鱼隶属于鲤形目、鲤科、裂腹鱼亚科、裸重唇鱼属，俗称裸黄瓜鱼、小白条等［1］。主要分布区域为新疆伊犁河、天山南部开都河和天山北坡诸多流域。新疆裸重唇鱼分布的水域生态环境复杂，具有海拔高、气候严寒、紫外线强烈、河水低温流急等特点，由此使得新疆裸重唇鱼进化演变为一种具有较强适应能力、遗传性能稳定的特有物种。由于新疆裸重唇鱼分布的不同水系间形成了天然隔离，使其种群间基因交流急剧减少，加之自然环境的恶化及人为过度捕捞等因素影响，新疆裸重唇鱼资源迅速衰退，2004年已被列为新疆维吾尔自治区一级水生野生保护动物。

线粒体DNA已被广泛应用于鱼类分子系统学研究［2-3］，Cytb基因是编码线粒体内膜细胞色素b氧化酶基因的亚基，是参与合成ATP过程电子传递链的一种重要物质。线粒体DNA的进化速率较快，Cytb基因在线粒体基因组中进化速度适中，其所提供的系统发育信息和遗传分化水平适用于分析种间或属间的差异、系统发育关系。细胞色素b基因已被广泛地应用于鱼类系统进化、种群遗传结构、亲缘地理学等方面的研究。目前，国内外有关新疆裸重唇鱼群体间遗传变异以及相互关系的研究较少，仅见有关可量性状、生态习性、人工繁殖、胚胎发育等方面的研究［1，4-5］。为此，本研究中基于线粒体DNA Cytb基因序列对不同流域的野生新疆裸重唇鱼群体的遗传多样性进行了分析，旨在为新疆裸重唇鱼资源的保护提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用4个野生新疆裸重唇鱼群体样本分别采自巩乃斯河（2013年7月15日，27尾）、玛纳斯河（2011年7月15日，24尾）、开都河（2013年7月17日，21尾）、喀什河（2011年7月13日，2尾），各河流鱼样群体编号分别为GNSH、MNSH、KDH、KSH。剪取鱼活体样本肌肉，于体积分数为95％的乙醇中固定，-80℃下保存备用。

1.2 方法

分别称取新疆裸重唇鱼肌肉样本0.05 g，参照黄立群等［3］的方法并加以改进提取DNA。将提取的基因组DNA用7 g/L琼脂糖电泳检测后分装，贮存于冰箱（-20℃）中备用。选取同属的厚唇裸重唇鱼线粒体DNA Cytb区通用引物［3］进行PCR扩增。用于扩增的引物分别为

PCR反应总体积为25μL，其中包括：10× PCR反应缓冲液2.5μL，基因组模板DNA（10 μg/mL）1μL，Taq酶（2 U/μL）0.5μL，dNTP（10 mmol/L）0.5μL，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，上、下游引物各（10μmol/L）1μL，用dd H2O补足至25μL。在Eppendorf PCR仪器上进行扩增，反应条件为：95℃下预变性2min；94℃下变性30 s，52℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共进行36个循环；最后在72℃下再延伸10 min，4℃下保存。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段割胶纯化回收，将纯化产物与PMD18-T载体进行连接。

连接反应体系为：PMD18-T载体1μL，PCR纯化产物1μL，SolutionⅠ5μL，ddH2O 3μL。4℃下连接，24 h后转入E.coli DH5α感受态细胞中。随后用加氨苄青霉素（Amp）的麦康凯固体培养基进行红白斑筛选，挑取白斑菌落于LB液体培养基中振荡培养12 h后制备成模板菌液。吸取1 μL模板菌液用于菌落PCR反应。PCR反应体系与基因组提取用PCR体系相同。用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测，将验证为阳性的菌液送生工生物工程上海有限公司测序。

1.3 数据处理

所得序列由DNASTAR软件［6］包拼接、校对和排序。通过ClustalX 1.83程序［7］比对线粒体DNA Cytb区序列。利用MEGA 5.0软件包［8］分析序列特征，统计碱基组成、转换与颠换值及群体遗传距离；用DNAsp 5.0［9］确定线粒体DNA Cytb区部分序列的单倍型，计算各群体的单倍型多样性（Hd）、平均核苷酸差异数（K）、核苷酸多态性（Pi）。运用Arlequin 3.1软件［10］计算新疆裸重唇鱼不同群体间的遗传分化系数（FST）。通过公式Nm=1/4（1/FST-1）计算群体间的基因流。采用邻接法（Neighbor-joiningtree，NJ），以同属双须叶须鱼Ptychobarbus dipogon（JQ082345）线粒体DNA Cytb区部分序列为外类群构建分子系统发育树。用Network软件构建中介网络图（Median-joiningnetwork），并检测种群单倍型间的进化关系。

2 结果与分析

2.1 序列变异比较

对测序的74尾新疆裸重唇鱼线粒体DNA Cytb区部分序列进行比对，共获得74条429～442 bp长度不等的同源序列。4个新疆裸重唇鱼群体的碱基组成变化不大（表1），其中碱基G含量明显低于其他碱基含量，碱基A+T含量高于C+G含量。

表1 新疆裸重唇鱼4个群体的线粒体DNA Cytb基因部分序列碱基组成Tab.1 Nucleotide com positions of m itochondrial DNA Cytb gene sequences in four populations of Gymnodiptychus dybowskii％

由表2可知，从开都河群体、巩乃斯河群体、喀什河群体、玛纳斯河群体分别检测到1、11、5、1个变异位点，分别占全部碱基数的0.71％、2.61％、1.19％、0.71％。4个群体中，开都河群体检测到1个颠换位点，巩乃斯河群体检测到5个颠换位点、1个转换位点，喀什河群体检测到2个颠换位点、1个转换位点，玛纳斯河群体检测到1个转换位点。4个群体中，共有15个变异位点，定义9个单倍型。其中巩乃斯河群体单倍型最多（6个），玛纳斯河群体、开都河群体次之（均为2个），喀什河群体最少（1个），在这些单倍型中包含2个共享单倍型Hap1、Hap2。

表2 新疆裸重唇鱼4个群体线粒体DNA Cytb基因部分序列的单倍型分布Tab.2 Distribution of hap lotypes of Cytb gene sequences in four populations of Gymnodiptychus dybowskii

2.2 群体遗传结构比较

从表3可见：喀什河群体的单倍型多样性最高，巩乃斯河群体次之，开都河群体最低；巩乃斯河群体的核苷酸多样性明显高于其他3个群体；开都河群体的平均核苷酸差异系数明显小于其他3个群体；开都河群体的遗传多样性为最低，巩乃斯河群体与喀什河群体的遗传多样性数值较为接近。

用Arlequin软件统计群体间遗传分化指数（FST），结果表明（表4），喀什河与巩乃斯河群体之间FST值最小（FST＜0.05），说明群体间分化较小；而玛纳斯河群体与其他3个群体间的FST值均较大（FST＞0.15），说明群体间分化较大。新疆裸重唇鱼4个群体间的基因流（Nm）值为0.873 34～18.490 60，其中开都河群体和玛纳斯河群体间的Nm最小，巩乃斯河群体和喀什河群体间的Nm最大。基因流较小意味着较高的遗传分化，而较高的基因流说明两个群体间有较紧密的基因交流。由此可见，巩乃斯河和喀什河群体存在紧密的基因交流，而玛纳斯河群体与其他3个群体间存在较大的地理群体分化。

表3 新疆裸重唇鱼4个群体遗传多样性分析Tab.3 Genetic diversity parameters in four populations of Gymnodiptychus dybowskii

表4 新疆裸重唇鱼4个群体间遗传分化系数（FST）（下对角线）及基因流（Nm）（上对角线）Tab.4 Pairw ise fixation index FST（above diagonal）and gene flow Nm（below diagonal）among the four populations of Gymnodiptychus dybowskii

2.3 聚类分析

采用邻接法构建分子系统树，4个群体中巩乃斯河群体与开都河、玛纳斯河、喀什河群体的单倍型交叉在一起，难以得到有效区分，而开都河、玛纳斯河群体的两个单倍型聚为一簇，其中采样个体较少的喀什河群体的单倍型虽然并未与其他群体分开自成一簇，但与巩乃斯河群体的单倍型也是交叉在一起，这表明这4个群体间遗传多样性系数较高、亲缘关系较近（图1）。

图1 新疆裸重唇鱼线粒体DNA Cytb基因序列单倍型NJ系统树Fig.1 Neighbor-joining tree based on hap lotypes of m itochrondrial DNA Cytb gene sequences in Gymnodiptychus dybowskii

由Network软件生成的单倍型分布统计简约网状图见图2。从图2可知，以优势单倍型Hap2为网络关系图的扩展中心，巩乃斯河、喀什河、玛纳斯河和开都河群体的所有单倍型以短支相连。巩乃斯河群体单倍型Hap5和喀什河群体的单倍型Hap6是在以Hap2为中心的基础上经2步变异产生。

图2 基于线粒体DNA Cytb区部分序列单倍型变异位点的统计简约网状图Fig.2 Statistical parsimony network inferred from m tDNA Cytb sequences

3 讨论

新疆裸重唇鱼作为一种新疆土著鱼种，分布于塔里木盆地诸水系及天山北坡的部分水系。新疆位于欧亚大陆腹地，长期的地质变迁造就了其独特的水系分布。这对水生生物物种间形成了天然的地理隔离，但也对研究物种的遗传分化，以及地理隔离对物种形成的影响提供了有益的帮助。

新疆裸重唇鱼线粒体DNA Cytb基因碱基组成具有A+T偏向性［11］，这与脊椎动物线粒体DNA均呈A+T偏向性的结论一致。遗传多样性是物种进化潜能的保证，而核苷酸多态性是衡量mtDNA遗传多样性的重要指标。新疆裸重唇鱼Cytb基因均呈现出较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性。这种高Hd、低Pi的遗传多样性模式［12-14］在鱼类种群中较为常见。由一个较小的有效种群经过短期快速增长成为一个大的种群，种群单倍型多样性积累较快，而核苷酸变异还未能积累［10］。

从群体遗传分化系数来看，新疆裸重唇鱼4个群体中，玛纳斯河群体与其他3个群体间的分化程度较大（0.182 92～0.222 55），而其他3个群体间的分化程度较低，因此，新疆裸重唇鱼群体间已经存在分化，尤其是玛纳斯河群体。群体间的遗传距离及种群分化指数是衡量群体多态程度的重要指标，两者值越大，群体多态性越高，玛纳斯河群体与其他群体间是由于地理隔离而导致的显著分化。研究遗传变异除群体间分化外，还有一个重要内容是群体间个体的分化，可考虑利用AMOVA分析［14］来检测不同群体内部遗传变异情况。

新疆裸重唇鱼是在特殊生境下演化出来的新疆本土特有的珍贵土著鱼种。21世纪初，在新疆渔业资源评估中，描述了仅在哈萨克斯坦境内的额尔齐斯河还栖息着部分新疆裸重唇鱼，整个疆内新疆裸重唇鱼资源面临濒危的现状。针对这种情况，政府有关部门于2010—2011年在新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州的伊犁河支流巩乃斯河开展了珍惜特有鱼类放流活动（共投放20万尾自治区一级和二级重点保护水生野生动物——新疆裸重唇鱼和新疆斑重唇鱼鱼苗）［15］。政府有关部门还对增值鱼类的生长发育进行监测，并严厉打击违法捕鱼、偷鱼、炸鱼等行为，针对伊犁河、额尔齐斯河的具体情况制定了禁渔期，配合人工增殖放流等行动来恢复新疆裸重唇鱼、斑重唇鱼等珍稀鱼类资源。

本研究中，由于喀什河新疆裸重唇鱼资源极度匮乏，只采集到2尾（代表性较弱，其有关数据分析具有局限性，不足以说明科学问题，仅供参考）。由于所涉及样品数量较少，因此，需要采用更多的分子技术手段来了解新疆裸重唇鱼的种质资源，如AFLP指纹等［16］。

虽然巩乃斯河与喀什河均为伊犁河的支流，但针对这种鱼类资源匮乏情况，巩乃斯河采取了必要的放流活动，而喀什河还未做出补救措施，两条河流鱼类资源状况也截然相反。本研究结果显示：巩乃斯河群体、喀什河群体遗传多样性较高，开都河群体最低；巩乃斯河群体、喀什河群体、开都河群体之间分化较小，而玛纳斯河群体与3个群体存在明显的分化。

基因流数据显示，巩乃斯河群体与各群体间基因流较大，且与喀什河群体间基因流极大（Nm= 18.4906）；而开都河群体与其他群体间基因流较小；喀什河群体与玛纳斯河群体间基因流小于1（Nm=0.9454），与开都河群体间的基因流大于1（Nm=1.8528），但数值较小。

综上所述，巩乃斯河群体与喀什河群体间存在极大的基因交流，除此之外，其他群体间基因交流不明显。巩乃斯河与喀什河同为伊犁河的支流，巩乃斯河在喀德明山附近与特克斯河汇合后再与喀什河汇合，最后流入巴士喀尔湖，巩乃斯河与喀什河的水生动植物间存在较大的基因交流，这也验证了本研究中的论述。

总体而言，4个群体的种质状况均不容乐观，巩乃斯河群体、开都河群体、喀什河群体的种质资源急需保护，涉水工程建设会在很大程度上影响对玛纳斯河新疆裸重唇鱼群体种质资源的保护，因此，加强渔业管理措施、设立专门的保护机构刻不容缓。

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An analysis of genetic diversity in Gymnodiptychus dybowskii based on m tDNA cytochrome b gene sequences

GUO Yang，HUWen-ge，MO Chao，WU Fei，WANG Cui-hua，MA De-cao，HE Yuan

（College of Life Science，Shihezi University，Shihezi832000，China）

In this study，partialmitochondrial DNA Cytb gene was extracted and analyzed by a biologicalmethod for software access to design the genetic diversity and structure in four populations（Kaidu River，Manas River，Kashi River，and Gongnaisi River）of Gymnodipty chusdybowskii.The results showed that 15 variable nucleotide sites and 9 haplotypeswere detected in 74 individuals，in which 1 variable siteswas found in twenty-one individuals in Kaidu River.Ten variable sites were found in the twenty-seven individuals in Gongnaisi River，5 variable sites in the two individuals in Kashi River and 9 variable sites in the twenty-four individuals in Manasi River.G. chusdybowskii had average haplotype diversity Hdof0.810 and nucleotide diversity Piof0.005 9.The pairwise fixation index（FST）revealed that there was a high genetic differentiation between the Manas River and other groups（FST＞0.15），and that a lower differentiation in the other groups（0.05＜FST＜0.15）.Gene flow（Nm）showed that there was a great river of gene flow between populations in Kashi River and Gongnaisi River.Neighbor-joining tree and Median-joining network of G.dybowskii also indicated that Kashi River populations and other population had farther relation in haplotypes，and that therewas close significant differentiation in the other haplotypes of the other three groups.The findings showed that four groups of G.chusdybowskii germplasm resources have suffered from great damage，and that fisheriesmanagementmeasures should be strengthened to set up a special protection agency.

Gymnodipty chusdybowskii；mitochondrial DNA cytochrome b gene；genetic diversity

S917.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.05.010

2095-1388（2016）05-0528-05

2016-01-20

新疆生产建设兵团科技攻关与成果转化项目（省级项目2015AC010）；石河子大学动植物育种专项（gxjs2011-yz01）

郭飏（1992—），男，硕士研究生。E-mail：564332156@qq.com

胡文革（1966—），女，博士，副教授。E-mail：hwg-t@163.com