金匮肾气丸对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织p-STAT3蛋白的影响

刘春燕，朱伟，唐群，梅文娟，陆苗苗，丁志高

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.南昌大学第一附属医院，江西南昌330006；3.辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121001）

·方药研究·

金匮肾气丸对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织p-STAT3蛋白的影响

刘春燕1，朱伟1，唐群1，梅文娟2，陆苗苗3，丁志高1

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.南昌大学第一附属医院，江西南昌330006；3.辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121001）

目的探讨金匮肾气丸对单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠肾间质纤维化的影响及对p-STAT3蛋白表达的影响。方法雄性SD大鼠30只，随机分为假手术组、UUO模型组、金匮肾气丸低剂量组、金匮肾气丸高剂量组、阳性对照药依那普利组，UUO术后第1天开始灌胃，第14天处死大鼠，取梗阻肾组织，HE和Masson染色观察肾组织病理改变，免疫组织化学检测I型和III型胶原在肾组织的蛋白表达，Real-time PCR法检测I型和III型胶原在肾组织的mRNA水平，Western印迹检测磷酸化的信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在肾组织的表达。结果与UUO模型组比较，金匮肾气丸治疗后，肾间质损伤指数降低，间质胶原阳性面积减少，I型和III型胶原蛋白及mRNA表达减少，磷酸化STAT3蛋白水平降低（P＜0.05）。结论金匮肾气丸可以减轻UUO大鼠梗阻肾组织肾间质损伤，减少间质内胶原沉积，其作用机制可能与抑制STAT3磷酸化有关。

金匮肾气丸；肾纤维化；单侧输尿管梗阻；大鼠；p-STAT3蛋白；熟地黄；山茱萸；山药

肾纤维化是指由各种原因引起的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分在肾组织内过度沉积，是所有慢性肾脏病进展到终末期肾病的共同途径和病理基础，控制肾纤维化，对于治疗慢性肾脏病、延缓慢性肾衰竭的进展起关键作用［1］。金匮肾气丸是张仲景《金匮要略》中的名方，广泛应用于泌尿生殖系统、神经系统、免疫系统等疾病治疗。现代药理学研究发现，金匮肾气丸可通过作用于糖皮质激素受体、淋巴细胞亚群、神经生长因子等靶点参与调节下丘脑-垂体-靶腺轴、免疫系统和神经系统等功能［2-3］，同时具有良好的抗器官纤维化作用［4］。本研究采用大鼠单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO），观察金匮肾气丸对大鼠肾间质纤维化的疗效，并探讨其作用机制是否与抑制STAT3磷酸化有关。

1　材料

1.1动物

清洁级健康雄性SD大鼠30只，4～6周龄，体质量180～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：4304702551。

1.2试药

金匮肾气丸购自北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，药丸碾碎并加生理盐水配成混悬液，浓度为0.25 g/mL。Masson三色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司；兔抗大鼠I型胶原多克隆抗体、兔抗大鼠III型胶原多克隆抗体、Fibronectin抗体购自美国Abcam公司；α-SMA抗体购自美国Sigma公司；p-STAT3（Ser727）和STAT3抗体购自美国Cell signaling technology公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo公司；SP免疫组织化学染色试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司；Real-time PCR试剂盒和逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。其他试剂为国产分析纯。

1.3仪器

BH-2光学显微镜购自日本Olympus公司，转移电泳槽和电泳仪购自上海天能科技有限公司，低温微型离心机购自Eppendorf公司，CFX96TM实时定量PCR仪、SDS PAGE微型凝胶电泳及转膜设备购自美国BioRad公司，酶标仪购自美国BioTek公司，全自动上液高速软片冲洗机购自江苏泰泉电子自动化设备有限公司。

2　方法

2.1实验分组及模型建立

所有大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表的方法，将30只大鼠分为假手术组、UUO模型组、金匮肾气丸低剂量组（1.25 g/kg）、金匮肾气丸高剂量组（2.5 g/kg）、阳性对照药依那普利组（10 mg/ kg），每组6只。除假手术组外，其余各组大鼠行左侧输尿管结扎手术建立UUO大鼠肾纤维化模型。每天1次给予相应药物灌胃，假手术组和UUO模型组灌胃等容量生理盐水。连续用药14 d，处死大鼠，取左侧肾组织标本。

2.2肾组织病理学检查

将肾组织于4%多聚甲醛固定24 h后，常规石蜡包埋切片，行HE和Masson染色。在200倍光学显微镜下观察HE染色切片，盲法依序观察右上、右下、中间、左上、左下5个肾小管间质视野，按肾间质损伤8项指标评分：肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质细胞浸润，计算均值［5］。在200倍光学显微镜下观察Masson染色切片，苯胺蓝将胶原纤维染成蓝色，盲法随机观察20个互不重叠视野，计算阳性面积占整个视野（避开大血管和肾小球）的百分比并计分，取均值。计分标准如下：0分，无染色；1分，＜25%阳性面积；2分，25～50%阳性面积；3分，50-75%阳性面积；4分，75～100%阳性面积［6］。

2.3免疫组织化学

采用SP法，按照试剂盒的操作步骤，检测I型和III型胶原在梗阻肾组织的表达。光镜下肾间质中条索状或波纹状棕黄色为阳性表达，200倍下随机采集20个皮质及外髓视野（除大血管外），运用Image Pro Plus 6.0图像分析软件分析阳性面积百分比，取均值［7］。

2.4Real-time PCR

总RNA提取及逆转录反应按说明书步骤进行。引物序列均根据Gene Bank，用Primer 5.0软件设计完成。Collagen I上游引物5'-TCAGGGGCGAAGGCAACA'-GT-3'，下游引物：5'-TTGGGATGGAGGGAGTTTACACGA-3'；Collagen III上游引物：5'-AAGGGCAGGGAACAACTGAT-3'，下游引物：5'-GTGAAGCAGGG-TGAGAAGAAAC-3'；β-actin上游引物：5'-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3'，下游引物：5'-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'。PCR反应总体积为10滋L，组分如下：SYBR Premix Ex Taq 5滋L，10滋M collagen I（或collagen III）上下游引物各0.25滋L，适当稀释的cDNA 0.5滋L，ddH2O 4滋L。反应条件为：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40个循环；再95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。实时荧光定量利用PCR技术通过2-ΔΔCT方法分析相对基因表达差异，数据分析采用下列公式：ΔΔCT=（CT.Target-CT.Actin）Time x-（CT.Target-CT.Actin）Time 0，Time x表示任意时间点，Time 0表示经β-actin校正后1倍量的目标基因表达。

2.5Western印迹

采用2×SDS裂解液提取肾组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，转PVDF膜。牛奶室温封闭1 h后，分别加入FN、α-SMA、p-STAT3/STAT3一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜，TBST洗3次，加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，TBST洗3次，用ECL显色并曝光，采用Image J软件进行条带灰度扫描。

2.6统计学分析

实验数据以“x±s”表示，运用SPSS 19.0统计软件进行分析。若数据符合正态分布及方差齐性，采用多组间单因素方差分析方法（LSD）；若数据方差不齐或不符合正态分布，进行秩转换后采用Kruskal-Wallis检验，P＜0.05时认为差异有统计学意义。

3　结果

3.1各组大鼠梗阻肾组织病理变化及肾间质损伤指数、胶原相对面积比较

光镜下观察肾组织HE和Masson染色切片并进行半定量分析，结果显示假手术组肾组织无明显病理改变；UUO模型组肾小管扩张，部分管腔内有蛋白质管型，肾小管上皮细胞萎缩或空泡变性，局部间质内有巨噬细胞、淋巴细胞浸润，间质内成纤维细胞增生、胶原纤维增多；金匮肾气丸低剂量和高剂量及依那普利治疗后，上述病变减轻，且金匮肾气丸高剂量组病变最轻。肾间质损伤指数评分显示，模型组与假手术组比较，肾间质损伤指数明显增高（P＜ 0.01）；各治疗组与模型组比较，肾间质损伤指数明显降低（P＜0.05），其中金匮肾气丸高剂量组肾间质损伤指数比依那普利组明显降低（P＜0.05），见表1、图1。对Masson染色胶原含量进行半定量分析发现，UUO模型组肾间质胶原阳性面积评分明显高于假手术组（P＜0.01），各治疗组肾间质胶原阳性面积评分显著降低（P＜0.05）；其中金匮肾气丸高剂量组评分最低，与依那普利组比较有统计学差异（P＜0.05），见表1、图2。

表1　各组大鼠梗阻肾组织肾间质损伤指数、胶原相对面积比较（x±s，n=5）

图1　各组大鼠肾脏病理学改变光镜图（HE染色×200）

图2　各组大鼠肾脏病理学改变光镜图（Masson染色×200）

3.2各组大鼠梗阻肾组织I、III型胶原的蛋白及mRNA表达情况

假手术组肾组织仅在血管周围有棕黄色胶原表达，肾间质中无I、III型胶原表达；14 d模型组肾间质可见大量染成棕黄色条索状的I、III型胶原表达；金匮肾气丸低、高剂量治疗组和依那普利治疗组肾间质I、III型胶原表达较模型组明显减少，I、III型胶原阳性面积百分比显著降低（P＜0.05），其中金匮肾气丸高剂量组的I、III型胶原阳性面积百分比低于依那普利对照组。模型组肾间质I、III型胶原mRNA表达水平明显高于假手术组（P＜0.05）；金匮肾气丸低、高剂量治疗组和依那普利治疗组肾间质I、III型胶原mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），其中金匮肾气丸高剂量组的I、III型胶原mRNA表达水平低于依那普利对照组。见图3。

图3　各组大鼠肾组织I、III型胶原蛋白及mRNA表达的比较光镜图×200（左列）及柱形图（右列）

3.3各组大鼠梗阻肾组织p-STAT3蛋白的表达情况

模型组大鼠肾组织p-STAT3表达水平明显增高（P＜0.01），金匮肾气丸低、高剂量治疗组和依那普利治疗组p-STAT3表达明显降低（P＜0.05），三个治疗组间没有显著性差异，见图4。

4　讨论

目前临床上治疗肾纤维化的措施主要包括两个方面：一是针对原发病的病因治疗，二是针对肾纤维化本身的治疗。原发病因的去除并不能完全抑制肾纤维化的发展，而肾纤维化病变反过来又可以影响原发病的治疗效果［8］，因此针对肾纤维化本身的治疗尤其重要。但是，目前临床缺乏有效的抗肾纤维化药物。血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ型受体拮抗剂是目前临床上应用较多的抗肾纤维化药物，但这两类药物均只能延缓肾纤维化的进程，并不能十分有效的阻止慢性肾脏病向终末期肾病的进展，而且在已存在肾功能衰竭患者中的应用尚存争议［9］。目前在研的抗肾纤维化药物主要有：抗转化生长因子-β拮抗剂、松弛素、秋水仙碱、己酮可可碱、肝细胞生长因子及骨形成蛋白-7等，但这些药物均仍处于临床前研究阶段，其临床实际疗效及毒副作用有待进一步验证，而且这些药物往往针对某一个导致纤维化的靶点，不能从整体上防治纤维化的发生。中医辨证论治，从整体上改善人体的内环境，从各个环节防治纤维化的发生。研究显示，中医药在防治肾纤维化方面具有广阔的前景。

图4　Western blot检测各组大鼠梗阻肾组织p-STAT3蛋白的表达电泳图（上）及柱形图（下）

中医认为，各种慢性肾病进展到肾功能衰竭的过程属阳气衰败，水湿瘀浊内聚，正虚邪实、脾肾衰败、浊毒内蕴、肾络瘀阻是其基本病理，虚、瘀、湿是其特点。肾纤维化早中期多见脾肾气虚或脾肾气阴两虚；随着病情进一步发展，肾虚气化乏力，脾虚水湿不运，湿浊日久化热、生毒、成瘀，变证丛生。正虚贯穿疾病始末，扶助正气是延缓和阻止慢性肾纤维化进程的重要方法。故需用温阳利水、化瘀降浊中药。肾气丸来源于东汉末年张仲景所著《金匮要略》一书，所以又名金匮肾气丸，是温补肾阳的代表方，也是最早的补肾方剂。方中用熟地黄滋阴补肾，山茱萸、山药补肝脾而益精血；以少量肉桂、附子温补肾阳，可微生少火以生肾气；泽泻、茯苓利水渗湿泄浊，牡丹皮清肝泻火、活血散瘀，调血分之滞，其与滋阴补肾药相配，意在寓泻于补，以泻助补。

本研究采用肾间质纤维化的经典动物模型UUO作为研究对象，观察金匮肾气丸对UUO大鼠肾间质纤维化的影响，并采用血管紧张素转换酶抑制剂依那普利作为阳性对照药。结果显示，金匮肾气丸低剂量、高剂量和依那普利组均能有效改善肾间质损伤，与模型组相比，肾小管上皮细胞空泡变性少，萎缩或扩张的肾小管少，间质胶原纤维沉积和炎症细胞浸润少（P＜0.05）；其中金匮肾气丸高剂量组病变最轻，且肾间质损伤指数评分低于依那普利组（P＜0.05）。同时，通过Masson染色，我们发现各治疗组的梗阻肾脏胶原纤维沉积比UUO组减少，胶原面积评分明显低于UUO组（P＜0.05）；其中金匮肾气丸高剂量组的评分低于依那普利组（P＜0.05）。I型和III型胶原是肾间质纤维化时细胞外基质的主要成分，因此通过免疫组织化学方法和real-time PCR方法来研究金匮肾气丸对梗阻肾间质中I、III型胶原的蛋白表达水平和mRNA表达水平的影响。结果显示，各治疗组均能显著下调I、III型胶原的蛋白和mRNA水平（P＜0.05），其中金匮肾气丸高剂量组的I、III型胶原的蛋白和mRNA水平显著低于依那普利组（P＜0.05）。

JAK/STAT信号通路是一条由多种细胞因子和生长因子介导的信号转导通路，参与细胞的增生、分化、凋亡及免疫调节等重要生理过程。STAT作为JAK的靶蛋白，是存在于胞质中的一个转录因子家族，其中STAT3是该家族的重要成员，且与肾脏疾病的关系最为密切［10-11］。多项研究证实，UUO模型肾间质中成纤维细胞的增殖及细胞外基质的增多与STAT3的激活相关［12-13］。本实验结果显示，UUO模型组大鼠梗阻肾组织中STAT3表达明显增高，金匮肾气丸治疗后可降低UUO梗阻肾组织中STAT3的表达，推测金匮肾气丸可能通过抑制STAT3的磷酸化来起到减轻肾间质纤维化的作用。

综上所述，金匮肾气丸可以减轻UUO梗阻肾组织肾间质损伤和胶原沉积，降低肾组织中I型和III型胶原的表达，并抑制STAT3的磷酸化；高剂量的金匮肾气丸对肾间质损伤的保护作用及减少胶原沉积的作用优于依那普利。所以认为，金匮肾气丸可以改善UUO模型肾间质纤维化，其作用机制可能与其抑制STAT3的磷酸化有关。

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（本文编辑杨瑛）

Effect of Jingui Shenqi Pill on the Expression of p-STAT3 in Unilateral Ureteral Obstruction Rats

LIU Chunyan1，ZHU Wei1，TANG Qun1，MEI Wenjuan2，LU Miaomiao3，DING Zhigao1
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China；3.The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China）

Objective To investigate the effect of Jingui Shenqi pill on unilateral ureteral obstruction（UUO）rats with renal interstitial fibrosis and the expression of p-STAT3 protein.Methods 30 male SD rats were randomly divided into sham operation group，UUO model group，low dose of Jingui Shenqi pill group，high dose of Jinguishenqi pill group，enalapril treatment group as positive control.After intragastric administration on the 14 days，the rats were sacrificed.The obstructive kidney tissues were stained with HE and Masson to observe the pathologic changes.The protein or mRNA expression of type I and III collagen in renal tissue was detected by immunohistochemistry staining or Real-time PCR.The phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）in renal tissue was detected by Western blot.Results Compared with UUO model group，after treatment with Jingui Shenqi pill，the renal interstitial damage index and collagen positive area weredecreased，theexpressionoftypeIandtypeIIIcollagenproteinandmRNAwerealsodecreasedandthe phosphorylation of STAT3 protein was inhibited（P＜0.05）.Conclusion Jingui Shenqi pill can obviously improve renal interstitial injury and reduce interstitial collagen deposition in UUO rats which may be related to the inhibition of STAT3 phosphorylation

Jingui Shenqi pill；renal fibrosis；unilateral ureteral obstruction rats；p-STAT3；prepared radix rehmanniae；semen corni；Chinese yam

R277.5；R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.10.006

2016-04-01

国家自然科学基金青年项目（81503442）；国家自然科学基金青年项目（81603470）；湖南省教育厅科研项目（11C0953）。

刘春燕，女，博士，研究方向：慢性肾脏病的防治，E-mail:liuchunyan0221@126.com。