脊髓NMDA受体NR2B参与前列腺炎致跨器官痛觉致敏的机制研究*

陈勇，张建华，赵涛，孙伟，袁梦娟

（重庆市涪陵中心医院泌尿外科408000）

脊髓NMDA受体NR2B参与前列腺炎致跨器官痛觉致敏的机制研究*

陈勇，张建华，赵涛，孙伟，袁梦娟

（重庆市涪陵中心医院泌尿外科408000）

目的研究N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体NR2B在慢性前列腺炎性刺激所致的跨器官痛觉过敏中的作用。方法采用完全氟氏佐剂前列腺注射制作慢性前列腺炎大鼠模型，用逆转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹技术分别检测NMDA受体NR2B亚基mRNA及蛋白表达水平的变化，以及鞘内给予NR2B特异性拮抗剂——ifenprodil对NR2B表达的影响。结果慢性炎性刺激后腰骶段脊髓背角NMDA受体NR2B表达上调，鞘内给予ifenprodil后NR2B在脊髓背角表达下调。结论NMDA受体NR2B可能参与了慢性前列腺炎导致的跨器官痛觉致敏，特异性NR2B拮抗可能是临床治疗慢性前列腺炎导致的慢性神经病理性痛的潜在策略。

受体，N-甲基-D-天冬氨酸；前列腺炎；跨器官痛觉致敏

近年来，有研究发现，内脏痛除内脏躯体牵涉痛外还有另外一个重要特点，即一个病变内脏器官的疼痛继发性引起相邻一个正常器官痛觉敏化，进而导致后者功能异常［1］。目前，国外学术界倾向于使用“cross-organ sensitization”，国内尚无统一译名，暂译为“跨器官痛觉致敏”［2］。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-asparate，NMDA）受体是一种配体门控离子型谷氨酸受体。有研究表明，NMDA受体NR2B亚基在疼痛的产生及中枢性痛觉敏化形成中具有重要作用，是一个潜在的镇痛治疗靶点［3］。作者进行的前期研究发现，腰骶段脊髓在前列腺炎导致的跨器官痛觉致敏中具有重要作用［4-5］。本研究采用逆转录-聚合酶链反应（reversetranscriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）技术定量观察了脊髓背角NR2B在前列腺炎性刺激后的时程表达变化，同时观察了鞘内给予NR2B拮抗剂后脊髓背角NR2B的表达变化。

1　材料与方法

1.1材料雄性SD大鼠80只，体质量180～200 g，由第三军医大学实验动物中心提供，随机分为假手术组（24只）、完全氟氏佐剂（complete freund adjuvant，CFA）组（24只）、ifenprodil组（16只）和空白对照组（16只）。

1.2方法

1.2.1模型制作采用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，取下腹正中切口，CFA组和假手术组分别于双侧前列腺腹叶各注射100 μL CFA和等量生理盐水。术前，术后7、14 d分批处死大鼠（每次各8只），观察脊髓背角NR2B mRNA及蛋白表达变化。ifenprodil组和空白对照组分别于CFA注射2周后行鞘内置管术（各16只），鞘内分别给予NR2B选择性拮抗剂——ifenprodil 200 nmol和等量生理盐水，持续注射7、14 d后处死，采用Western blotting技术观察NR2B蛋白表达变化。

1.2.2NR2B蛋白表达的检测采用戊巴比妥钠麻醉大鼠并断头处死。取L1～2段双侧脊髓背部部分，用预冷磷酸盐缓冲液冲洗组织后置入离心管中。称质量并分别标记。采用常规方法提取蛋白，Lowry测定蛋白含量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，蛋白转印（150 mA，3 h），免疫印迹及检测（NR2B兔多克隆抗体1∶200稀释），凝胶扫描系统分析蛋白条带吸光度，用Quantity One4.4软件分析图像，用积分光密度值（integrated optical density，IOD）比较蛋白的表达。

1.2.3NR2B mRNA表达的检测采用RT-PCR检测NR2B mRNA表达。大鼠麻醉后断头，分离L6～S1脊髓，采用Tripure法提取总RNA，测定并计算A260/A280比值及RNA水平，按常规方法制备cDNA。NR2B亚基引物，上游5′-TGGCGGTCTTTTTTCGTT-3′，下游5′-GCATTGCC TCCTTGATTTGG-3′，扩增片断长度：114 bp；β-actin引物：上游：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增片断长度：150bp。反应条件：94℃4 min、94℃20 s、60℃25 s，循环35次；72℃10 min。用Gel Doc 2000凝胶图像分析系统进行分析，计算目的基因电泳条带吸光度×面积值与各自的βactin比值，以样本/对照比值表示基因表达水平。

1.3统计学处理应用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用方差齐性检验、t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1前列腺炎性刺激后双侧脊髓背角NR2B蛋白表达增多术后7、14 d CFA组大鼠脊髓背角NR2B蛋白表达均显著高于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1　前列腺炎性刺激对L1～2脊髓背角NR2R蛋白表达的影响（±s，IOD）

表1　前列腺炎性刺激对L1～2脊髓背角NR2R蛋白表达的影响（±s，IOD）

注：与假手术组同时间点比较，aP＜0.01；与同组术前比较，bP＜0.01。

组别CFA组假手术组n术前术后7 d术后14 d 19.48±1.95ab12.34±1.42 88 10.23±1.42 10.38±1.11 20.05±1.86ab13.17±1.63

2.2前列腺炎性刺激后双侧脊髓背角NR2B mRNA表达增多术后7、14 d CFA组大鼠脊髓背角NR2B mRNA表达均显著高于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；术后7 d CFA组大鼠脊髓背角NR2B mRNA表达与术后14d比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2　前列腺炎性刺激对L6～S1脊髓背角NR2B mRNA表达的影响（±s，copy/μL）

表2　前列腺炎性刺激对L6～S1脊髓背角NR2B mRNA表达的影响（±s，copy/μL）

注：与假手术组同时间点比较，aP＜0.01；与同组术前比较，bP＜0.01。

组别CFA组假手术组n术前术后7 d术后14 d 7.83±0.37ab4.91±0.42 88 4.11±0.21 4.08±0.25 7.89±0.65ab4.83±0.43

2.3鞘内连续给予ifenprodil后双侧脊髓背角NR2R蛋白表达下调术后7、14 d Ifenprodil组大鼠脊髓背角NR2R蛋白表达显著低于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表3。

表3　鞘内连续给予ifenprodil对脊髓背角NR2R蛋白表达的影响（±s，IOD）

表3　鞘内连续给予ifenprodil对脊髓背角NR2R蛋白表达的影响（±s，IOD）

注：与空白对照组同时间点比较，aP＜0.01；与同组术前比较，bP＜0.01。

组别Ifenprodil组空白对照组n术前术后7 d术后14 d 88 19.77±1.20 18.87±1.10 13.85±1.51ab17.46±1.29 12.47±2.18ab18.12±1.13

3　讨论

疼痛是慢性前列腺炎患者最主要的症状，也是影响患者生活质量的主要因素。不同患者虽然病因不同，但疼痛性质和特点相似；疼痛部位分布在与膀胱、尿道神经支配相关的腰骶神经支配区；部分患者可能还存在膀胱、尿道功能异常。目前，对其疼痛产生的原因尚无满意的解释，也无有效的治疗方法［6］。

跨器官痛觉致敏是近年来提出的关于内脏疼痛的一种新理论［1-2］，即一个病变内脏器官的疼痛继发性引起另一个相邻器官痛觉敏化，进而导致后者功能异常。盆腔器官的某些病变与神经系统疾病一样能引起膀胱过度活动，如慢性脊髓损伤、直肠炎、宫颈疾病等［6-7］。直肠炎症能引起膀胱感觉神经元过敏，进一步引起膀胱过度活动［8］。肠易激综合征患者出现泌尿系统相关临床表现的概率显著增高，包括尿频、尿急、夜尿等［9］。跨器官痛觉致敏理论为前列腺炎导致的疼痛及相关器官功能障碍提供了一个全新的思路。

内脏-躯体和内脏-内脏感觉传入会聚在盆腔跨器官痛觉致敏产生中具有重要作用［4-5］。作者前期研究发现，前列腺和膀胱感觉神经在腰骶段背根神经节会聚，慢性炎性对会聚细胞的数量无影响，但能显著增加腰骶段背根神经节的瞬时感受器电位香草酸受体1（transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1）和神经生长因子的表达［10］。同时前列腺炎性刺激可引起膀胱功能改变。在一定程度上证实了前列腺炎可能导致跨器官痛觉过敏，但其具体机制仍不清楚。

NMDA受体在体内神经发育、突触可塑性、学习、记忆及痛觉信号传导等生理病理过程中发挥着重要作用［11］。NR2B是NMDA的一个重要亚基，参与了外周痛觉感受阈扩大、中枢过度兴奋及痛觉过敏的形成［3］，在疼痛的产生及中枢性痛觉敏化形成中具有重要作用［12］。

本研究采用CFA刺激前列腺制作了前列腺炎疼痛模型，结果发现，NMDA受体NR2B亚基在腰骶段脊髓背角高表达，术后7、14 d CFA组大鼠脊髓背角NR2B蛋白表达均显著高于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.01），鞘内给予NR2B特异性拮抗剂——ifenprodil后NR2B表达下调。Ifenprodil可能通过减少NR2B mRNA的方式或增加NR2B降解的方式发挥作用，但具体机制尚不清楚［13］。因此，作者推测，NMDA受体NR2B亚基在前列腺炎导致的跨器官痛觉致敏中具有重要作用。同时作者以往研究发现，前列腺炎性刺激后腰骶段背根神经节和脊髓背角的TRPV1表达同样增多，而TRPV1参与了排尿反射，病理情况下与膀胱炎性痛、痛觉过敏及膀胱刺激症状有关［10］。但TRPV1与NMDA受体NR2B之间有无联系尚需进一步研究。

综上所述，NMDA受体NR2B参与了前列腺炎导致的跨器官痛觉过敏状态的形成与维持，但具体机制尚需进一步研究。鉴于NMDA受体在慢性疼痛的发生、发展过程中发挥着重要作用，对NR2B进行选择性拮抗可能成为脊髓损伤后慢性疼痛治疗的新策略。

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Study on mechanism of spinal cord NMDA receptor NR2B participating in cross-organ pain sensation sensitization caused by prostatitis*

Chen Yong，Zhang Jianhua，Zhao Tao，Sun Wei，Yuan Mengjuan（Department of Urological Surgery，Fuling District Central Hospital，Chongqing 408000，China）

ObjectiveTo investigate the role of N-methyl-D-aspartate（NMDA）receptor NR2B in the cross-organ pain sensation sensitization caused by inflammation stimulation of chronic prostatitis.MethodsThe prostatic injection of complete Freund adjunvant（CFA）was adopted to establish the rat chronic prostatitis model.The changes of NR2B subunit mRNA and protein expression levels were detected by using the Western blot and RT-PCR methods.Furthermore，the influence of NR2B specific antagonist ifenprodil by intrathecal injection on NR2B expression was investigated.ResultsThe expressions of NR2B in the spinal dorsal horn of lumbosacral segment after chronic inflammatory stimulation was up-regulated，while which after the intrathecal administration of ifenprodil was down-regulated.ConclusionThe NMDA receptor NR2B may be involved in the cross-organ pain sensation sensitization caused by chronic prostatitis.Therefore specific NR2B may be a potential strategy for treating chronic neuropathic pain induced by chronic prostatitis.

Receptors，N-methyl-D-aspartate；Prostatitis；Cross-organ sensitization

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.005

A

1009-5519（2016）12-1792-02

重庆市科委自然科学基金资助项目（cstc2012jja10104）。

陈勇（1971-），博士研究生，主任医师，主要从事慢性前列腺炎的发病机制及治疗的研究。

（2016-03-08）

（2016-04-03）